Marcadores genéticos de resposta à terapêutica na infeção crónica pelo vírus da hepatite C

Abstract

O vírus da hepatite C (VHC) é a causa mais frequente de cirrose hepática e carcinoma hepatocelular em todo o mundo. A terapia atual combinada, com interferão peguilado e ribavirina, apenas é eficaz em 50-60% dos pacientes infetados. A identificação de marcadores de previsão da resposta virológica sustentada (RVS, correspondendo a ausência de RNA viral no soro do doente, 24 semanas após o fim do tratamento), relacionados com o hospedeiro ou com o vírus, tem permitido a individualização do protocolo terapêutico e melhorar as taxas de sucesso. Relativamente ao hospedeiro, vários polimorfismos em genes chaves do processo viral e imunológico, têm sido investigados, embora nenhum deles tenha ainda entrado na prática clínica. Neste trabalho pretendemos avaliar a correlação de dois polimorfismos do hospedeiro com a resposta viral à terapia combinada com IFN. Os polimorfismos selecionados foram o rs12979860, situado a montante do gene da IL28B, o polimorfismo que até hoje mostrou uma maior correlação com a resposta à terapêutica, e o rs2287622 (habitualmente denominado por V444A), localizado no gene ABCB11, que codifica uma proteína transportadora de sais biliares (BSEP), tendo este SNP sido anteriormente correlacionado com um défice funcional da proteína e com o desenvolvimento de cirrose em doentes infetados pelo VHC. A amostra de população estudada era constituída por 117 doentes, seguidos no Serviço de Doenças Infeciosas dos CHC/CHUC, 67% dos quais era do sexo masculino. Para a genotipagem utilizou-se o método de sequenciação automática para o polimorfismo rs12979860, e a técnica de RFLPs para o polimorfismo V444A. A quantificação da carga viral no soro dos doentes foi realizada pelo teste COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HCV (Roche), um teste de RT-PCR em tempo real, e a genotipagem do vírus pelo teste VERSANT HCV Amplification 2.0 (LiPA), uma tecnologia baseada na RT-PCR e na hibridização reversa com sondas específicas para os vários genótipos virais. Para a correlação com a resposta à terapêutica apenas se incluíram os doentes que tinham terminado o tratamento há mais de 24 semanas, correspondendo a 91 doentes. Para os dois polimorfismos, as frequências alélicas e genotípicas encontradas foram semelhantes às descritas para populações caucasianas e respeitavam o equilíbrio de Hardy-Weinberg. Relativamente ao marcador da IL28B, o rs12979860 (uma V transição C > T), 12,8% dos pacientes apresentaram o genótipo de risco, TT. Os pacientes homozigóticos para o alelo C apresentam uma probabilidade de atingir a RVS cerca de 5 vezes superior à dos doentes homozigóticos para o alelo T (P = 0,0069; OR =5.1; IC95%: 1.56 - 16.64). Para o polimorfismo V444A, (uma transição T > C), verificou-se um aumento da frequência do genótipo TT, correspondente a uma maior capacidade funcional do transporte de sais biliares, nos doentes que alcançaram a RVS (20.9% versus 4.2%), embora sem significado estatístico. No que diz respeito aos outros marcadores de resposta já estabelecidos, os genótipos virais 2 e 3 associaram-se a maior probabilidade de RVS (P = 0.008; OR = 7.89; IC95%: 1.71 - 36.55), reforçando a necessidade de uma abordagem terapêutica específica para os pacientes infetados com os genótipos 1 e 4; e a presença de resposta virológica precoce (RVP, definida por, redução superior a 2 log10 dos níveis iniciais de RNA do VHC no soro do paciente às 12 semanas de terapia), surgiu com marcador essencial para a decisão terapêutica, visto só os doentes com RVP alcançaram a RVS. Neste estudo, a carga viral inicial não mostrou estar associada com a resposta à terapêutica. Na análise da associação dos polimorfismos estudados com o genótipo viral, carga viral, idade e RVP não se obteve também significância estatística. Estes resultados confirmam a relevância do marcador da IL28B na previsão da resposta à terapêutica na população portuguesa. Relativamente ao polimorfismo do gene ABCB11, os resultados sugerem uma possível associação, mas é necessário prosseguir os estudos com uma amostra de doentes de maior dimensão. A identificação de fatores genéticos e não genéticos que influenciem a resposta à terapêutica é essencial para que se criem modelos integrados de risco clinicamente úteis. Com a introdução de novos fármacos, estes modelos podem permitir selecionar quais os doentes que poderão continuar a fazer a terapêutica baseada no INF, e qual o esquema terapêutico mais adequado, e quais os que beneficiarão de outras abordagens.

The hepatitis C virus (HCV) is the most frequent cause of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma worldwide. Current combined therapy with pegylated interferon and ribavirin is only effective in 50-60% of infected patients. The identification of predicting markers for the sustained virologic response (SVR, corresponding to absence of viral RNA in patient serum, 24 weeks after the treatment), related to the host or the virus, has allowed the individualization of treatment protocol and improvement of success rates. As far as the host is concerned, several polymorphisms in key genes of viral and immune process have been investigated, although, until the moment, none have entered in clinical practice. In this work we intended to evaluate the correlation of two polymorphisms of the host with the viral response to combination therapy with IFN. The selected polymorphisms were rs12979860, upstream of the IL28B gene, which is the polymorphism with the highest correlation with response to therapy until these days, and rs2287622 (commonly referred to as V444A), located in the ABCB11 gene, which encodes a bile salt transporter protein (BSEP). This SNP has been previously correlated with a functional impairment of the protein encoded by the mentioned gene and the development of cirrhosis in patients infected with HCV. The sample population consisted of 117 patients followed at the Department of Infectious Diseases of the CHC/CHUC, 67% of which were male. Patient genotyping was performed by the automated sequencing method for the rs12979860 polymorphism, and by the RFLP technique for V444A polymorphism. The quantification of viral load in patient’s serum was performed by the COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HCV (Roche), which is a real time RT-PCR and the genotyping was performed by the VERSANT HCV Amplification 2.0 test (LiPA), a technology based on RT-PCR and reverse hybridization with probes specific for various viral genotypes. The correlation with therapy response only included patients who had completed the treatment for more than 24 weeks. As it is, this study comprised 91 patients. For both polymorphisms, the allelic and genotypic frequencies found were similar to those described for Caucasian populations and respected the Hardy-Weinberg equilibrium. For the marker of IL28B, the rs12979860 (a transition C> T), 12.8% of patients had the risk genotype, TT. The patients homozygous for the C allele have a probability of achieving SVR about 5 times higher than patients homozygous for the T allele (P = 0.0069; OR = 5.1; 95%CI: 1.56 - 16.64). Concerning V444A polymorphism (transition T> C), there was an increase of frequency of TT genotype corresponding to a greater functional ability to transport bile salts in patients who achieved SVR (20.9% versus 4.2%) although it is not statistically significant. Regarding other already established response markers, viral genotypes 2/3 were associated with a higher probability of SVR (P = 0.008; OR = 7.89; 95%CI: 1.71 - 36.55), reinforcing the need of a specific therapeutic approach for infected patients with genotype 1/4 and the presence of early virologic response (EVR, defined by a reduction of more than 2 log10 of the baseline HCV RNA levels in the patient serum at 12 weeks of therapy), emerged as an essential marker for therapeutic decision, as only patients with EVR achieved SVR. In this study, we were not able to associate initial viral load with response to therapy. There was also no statistical significance when studied polymorphisms mentioned above were compared with viral genotype, viral load, age and EVR. These results confirm the relevance of the marker of IL28B in predicting response to therapy in the Portuguese population. For the ABCB11 gene polymorphism, the results suggest a possible association, but it is necessary futher studies with a larger sample of patients. The identification of genetic and nongenetic factors that influence response to therapy is essential in order to create integrated clinically useful models of risk. With the introduction of new drugs, these models may allow to select the patients which may continue doing therapy based on the INF and which is the most appropriated therapeutic regimen as well as which ones will benefit from other approaches.