Pesquisa de marcadores genéticos para a retinopatia diabética pela genotipagem de SNPs em genes candidatos

Abstract

A Diabetes Mellitus (DM) é uma doença metabólica caracterizada pela hiperglicémia, que a longo prazo leva a complicações que afetam vários órgãos, como os olhos, onde se desenvolve a retinopatia diabética (RD). A RD resulta de uma complicação microvascular da retina que pode culminar em cegueira. Esta doença afeta cada vez mais indivíduos com diabetes em todo o mundo. Em 2011, Portugal continental já registava 34,5% de diabéticos portadores de RD. Para além da hiperglicémia, outros fatores de risco estão envolvidos, nomeadamente a idade de início da diabetes, o estilo de vida e os fatores genéticos do diabético. Numa fase inicial, as lesões associadas à RD podem ser reversíveis, contudo, nessa fase, a doença não apresenta sintomas. A identificação de marcadores genéticos que permitam delinear os diabéticos com suscetibilidade para o desenvolvimento de RD agressiva e de progressão rápida pode constituir a base para a seleção dos indivíduos que necessitam de uma vigilância clínica mais apertada. Em adição, a identificação destes marcadores poderá contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos moleculares que acompanham o desenvolvimento da doença podendo contribuir para o aparecimento de novos alvos terapêuticos. O presente estudo teve como objetivo a pesquisa de alterações genéticas, os SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), em 307 indivíduos, portugueses, diabéticos do tipo 2 com RD. Tratou-se de um estudo caso-controlo em que os doentes foram classificados em 3 fenótipos diferentes: A - indivíduos com RD não progressiva (grupo controlo), B - indivíduos com RD intermédia entre os fenótipos A e C, e C - indivíduos com RD agressiva e de progressão rápida. Num estudo prévio 200 SNPs foram selecionados a partir de 11 genes candidatos, de forma manual e com recurso a ferramentas bioinformáticas. Destes, 172 foram genotipados pelo sistema TaqMan® OpenArray®, tendo sido verificadas diferenças estatisticamente significativas entre o fenótipo A (controlo) e os fenótipos B e C para alguns SNPs dos genes NOS1, MTHFR, ACE e AGER, associando-os com o desenvolvimento de RD. Neste trabalho foram selecionados 8 SNPs dos 28 que não foram genotipados pelo sistema TaqMan® OpenArray®. Por apresentarem características com maior potencial foram escolhidos os SNPS: NOS1_rs77074921, NOS1_rs76839820, MTHFR_rs72552099, ACE_rs8075924, ACE_rs4357, ACE_rs121912703, ACE_rs113110741 e ACE_rs12720744 e para a sua análise foi eleita a técnica Allele-Specific PCR (AS-PCR) com deteção por desnaturação de alta resolução (MeltDoctor). De acordo com os resultados finais, os SNPs NOS1_rs77074921, NOS1_rs76839820, MTHFR_rs72552099, ACE_rs121912703 e ACE_rs113110741 foram monomórficos nos 307 doentes. Para o ACE_rs8075924, foram detetados os 3 genótipos possíveis, mas as frequências alélicas e genotípicas foram distribuídas igualmente pelos 3 fenótipos pelo que não são associáveis com o desenvolvimento da doença. Os ACE_rs4357 e ACE_rs12720744 poderão ser interessantes e estar associados com a progressão da doença, mas estudos adicionais serão necessários para delinear estas eventuais correlações. A genotipagem por AS-PCR foi confirmada por sequenciação de Sanger. Neste processo foram identificados 3 novos SNPs: MTHFR_rs1801131, ACE_rs12720743 e ACE_rs4363. O rs1801131 verificou-se ser um tagged-SNP do rs4846049, estudado por TaqMan® OpenArray®. Os SNPs ACE_rs12720743 e ACE_rs4363, apesar do número de indivíduos estudados ser reduzido, poderão vir a ser interessantes, porque embora sejam intrónicos, o primeiro corresponde a uma deleção presente nas amostras que também apresentam heterozigotia para o ACE_rs12720744, não se registando esta heterozigotia para os indivíduos sem a deleção em ACE_rs12720743, e o segundo porque se situa numa zona de splicing (6 bases afastado do exão) e por isso pode afetar a transcrição e posteriormente a tradução na proteína.

Diabetes Mellitus (DM) is a metabolic disorder characterized by hyperglycemia, which leads to long-term complications that affect several organs such as eyes, where diabetic retinopathy develops (DR). DR is a microvascular complication of retina that may result in blindness. This disease has become more common among people with diabetes worldwide. In 2011, Portugal had registered 34,5% of diabetic patients with DR. In addition to hyperglycemia, other risk factors are involved, including the age of onset, lifestyle and genetic factors. Lesions associated with DR may be reversible at an initial stage; however the disease is asymptomatic. The identification of genetic markers that allow identification of diabetic patients with susceptibility to develop aggressive DR and rapid progression may constitute the basis for selection of individuals who require a closer clinical monitoring. In addition, the identification of these markers may contribute to a better understanding of the molecular mechanisms related to the development of the disease and may also contribute to the discovery of new therapeutic targets. The aim of the present study was to find genetic alterations, SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), in 307 type 2 diabetic Portuguese patients with DR. This was a case-control study and patients were classified into three different phenotypes: A - individuals with non-progressive DR (control group), B - individuals with intermediate DR phenotypes between A and C, and C - individuals with aggressive and rapid progression of DR. In a previous study 200 SNPs were selected from 11 candidate genes manually and using bioinformatics tools. From the 200 selected SNPs, 172 were then genotyped by TaqMan® OpenArray® genotyping system and the results showed statistically significant differences between A (control) and B and C phenotypes for some SNPs located in NOS1, MTHFR, ACE and AGER genes, which allow the association of these SNPs with the development of DR. In this study 8 SNPs from the 28 missing SNPs were selected, due to higher deleterious potential: NOS1_rs77074921, NOS1_rs76839820, MTHFR_rs72552099, ACE_rs8075924, ACE_rs4357, ACE_rs121912703, ACE_rs113110741 and ACE_rs12720744. The SNPs were studied by the technique Allele-Specific PCR (AS-PCR) with detection by high-resolution denaturation (MeltDoctor). According to the final results, NOS1_rs77074921, NOS1_rs76839820, MTHFR_rs72552099, ACE_rs121912703 and ACE_rs113110741 SNPs were monomorphic in the 307 patients. Although the three possible genotypes were detected for ACE_rs8075924, the allele and genotype frequencies were also distributed equally among the three phenotypes, indicating lack of association with disease development. ACE_rs4357 and ACE_rs12720744 could be interesting and be associated with the progression of DR, but further studies are needed to delineate these possible correlations. The genotyping results by AS-PCR were confirmed by Sanger sequencing. The sequence analysis resulted in the identification of 3 new SNPs: MTHFR_rs1801131, ACE_rs12720743 and ACE_rs4363. The rs1801131 was found to be a tagged-SNP of rs4846049, genotyped by TaqMan® OpenArray® genotyping system. ACE_rs12720743 and ACE_rs4363, although intronic and only genotyped for 40 individuals, may be interesting. The first is a deletion and appeared in all the patients heterozygous in ACE_rs12720744, but not in those homozygous in this position. The second SNP is in a splice site (6 bases away from exon) and therefore could affect the transcription and subsequent translation into protein.