Validation of Tau aggregation model in HEK cells and cortical rat neurons

Abstract

A proteína Tau esta envolvida no assembly e na estabilização dos microtúbulos (MT) contribuindo para a normal função destes. Alterações na quantidade e na estrutura da Tau, como é o caso da hiperfosforilação, desencadeiam a libertação da Tau que medeia a estabilização dos MT, levando ao sequestro desta, formando agregados. Este processo pode estar envolvido em muitas doenças neurodegenerativas referidas como Tauopatias, como e o caso da doença de Alzheimer. Uma das características mais evidentes da doença de Alzheimer é a formação de tranças neurofibrilares compostas por deposições intracelulares de agregados de Tau hiperfosforilados. Contudo, o mecanismo que está na origem da transformação de Tau solúvel em agregados insolúveis, bem como o mecanismo envolvido na propagação dos agregados, continua sem explicação. Um modelo in vitro que reproduza as principais características envolvidas na doença pode ser uma útil ferramenta para estudar as causas e consequências da agregação da Tau. No presente estudo, foram optimizados dois modelos celulares, um em que foram utilizadas células QBI e outro em que foram utilizados neurónios corticais de rato. As culturas foram expostas a fibrilas pré-agregadas sinteticamente produzidas, a partir de Tau recombinante (K18P301L), que podem recrutar Tau endógena solúvel transformando-a em agregados insolúveis. A vantagem destes modelos é o rápido processo de agregação, uma vez que com o uso das fibrilas o passo limitante, a nucleação, é ultrapassado, e a transformação de Tau de forma monomérica em agregados é acelerada. Foi provado que em culturas neuronais primarias as fibrilas pré-agregadas são absorvidas espontaneamente, não sendo necessário o uso de nenhum reagente de entrega, o que leva a crer que este processo é mediado por endocitose. A indução de agregação endógena através das fibrilas de Tau sintéticas é um processo dependente do tempo de exposição, uma vez que foi detectado um aumento de agregação com um aumento do tempo de exposição às fibrilas, o que representa um ponto de suporte na hipótese de propagação patológica da Tau. No presente estudo foi também descrito que o processo de agregação desencadeado no modelo de agregação neuronal hTauP301L, não é um processo neurotóxico. Os modelos descritos neste estudo foram utilizados como uma plataforma para testar compostos que têm como finalidade diminuir os níveis de agregação da Tau. Neste estudo, foi também testado um inibidor de Hsp90 que demonstrou um evidente efeito na diminuição da Tau solúvel e insolúvel. Utilizando os modelos celulares apresentados, no presente estudo foi testado o processo da agregação da Tau em células. Foram desenvolvidos dois ensaios, um ensaio de BRET e um ensaio de Venus split complementation para estudar o processo de agregação da Tau no QBI seeding model. Resumidamente, o estudo apresentado tem por objectivo estabelecer uma relevante plataforma que pode ser utilizada para o estudo da patologia da Tau, bem como identificar futuras terapias com base na proteína Tau.

Tau protein promotes assembly and stabilization of microtubules (MT), which contributes to proper neuronal function. Alterations in the amount and structure of Tau protein, as hyperphosphorylation, results in detachment from MTs and sequestration into aggregates leading to a loss of Tau-mediated MT stabilization. This process is present in some neurodegenerative disorders referred as Tauopathies, such as Alzheimer Disease (AD). One of the major hallmarks of the AD is the formation of neurofibrillary tangles (NFTs) composed of intracellular deposition of hyperphosphorylated Tau aggregates. However the mechanisms causal of the conversion of soluble Tau in insoluble Tau aggregates, as well the propagation of Tau aggregates remains inconclusive. An in vitro system recapitulating the characteristics of this disease would provide a useful tool to study the causes and consequences of Tau aggregation. In this study, we optimized two cellular models, in QBI cells and in rat cortical neurons, wherein synthetic pre-aggregated fibrils made from recombinant protein (K18P301L) introduced in cell cultures can recruit soluble endogenous Tau into insoluble fibrillar aggregates. The advantage of these models is a faster aggregation process once the fibrils can overstep the rate limiting nucleation and accelerate the transformation of monomeric Tau into aggregates. We found that pre-aggregated fibrils are spontaneously taken up by primary cortical neurons and that this does not require any delivery reagent. This could mean that the uptake of this material is mediated by endocytosis. The induction of endogenous aggregation by synthetic Tau fibrils is a time-dependent process, since we observed an increase in Tau aggregation with increasing exposure time to fibrils, supporting the hypothesis of propagation of pathological Tau. We also found that the aggregation process triggered in the hTauP301L neuronal aggregation model is not a neurotoxic process to rat cortical neurons. The models described in this study were used as a platform to test compounds that could potentially decrease the levels of Tau aggregation. In this study an HSP90 inhibitor was test that demonstrated evident effects in decreased of soluble and insoluble Tau. The cellular models present here, were also used to study Tau aggregation process in life cells. In this study, we developed two assays, a BRET assay and a Venus split complementation assay to study Tau aggregation process in the QBI seeding model. In summary, we have developed and optimized a platform which can be used to study the pathogenesis of Tauopathies, and indentify new Tau-based therapies.