Role of local protein synthesis in presynaptogenesis

Abstract

Os neurónios são células altamente especializadas que recebem, processam e transmitem informação para outras células. Durante muitos anos, e até à descoberta de poliribossomas na base das dendrites, a ideia predominante era que todas as proteínas eram traduzidas no corpo celular e depois transportadas para as neurites. Contudo, esta visão canónica tem sido posta em causa nas últimas décadas e actualmente está estabelecido que a síntese proteica local ocorre em dendrites. A tradução local em dendrites tem sido objecto de intensos estudos e é de particular importância na plasticidade sináptica, nomeadamente durante o LTP e o LTD. Por outro lado, a síntese proteica nos axónios é ainda pouco conhecida. Surpreendentemente, estudos recentes identificaram um grande número de mRNAs localizados em axónios distais e em cones de crescimento, sugerindo que a tradução intra-axonal pode ter um papel importante em diferentes fases do desenvolvimento neuronal. Em linha com estas evidências, estudos recentes em axónios demonstraram a necessidade da existência de tradução local durante as respostas quimiotróficas dos axónios a guidance cues. Além disto, foi demonstrado que a síntese proteica local é necessária para outros mecanismos do neurodesenvolvimento, tais como o crescimento axonal, a capacidade de resposta dos axónios, a sobrevivência neuronal e a regeneração axonal. Estudos recentes no organismo modelo Aplysia sugerem que a tradução local possa ser importante para a sinaptogénese, devido à observação de agregados de mRNAs e de proteínas em locais de contacto sináptico. Curiosamente, foi também observado em Aplysia que a formação sináptica induz a transcrição do mRNA sensorina. Contudo, a sensorina não tem uma proteína homóloga nos mamíferos e a relevância destas observações para sistemas modelo de mamíferos continua por elucidar. Neste trabalho nós investigámos a necessidade de síntese proteica local na diferenciação pré-sináptica. Usando FGF22, uma molécula organizadora da pré-sinapse, e uma nova plataforma, as câmaras microfluidicas que permitem a separação física dos axónios dos corpos celulares e das dendrites, nós fomos capazes de manipular especificamente axónios sem a contribuição do corpo celular. Usando culturas primárias de neurónios do hipocampo de embriões de rato em câmaras microfluidicas nós estimulámos especificamente axónios distais com FGF22 e determinámos os “hot spots” da tradução axonal de mRNAs. Para isto, avaliámos os níveis de p-4E-BP1, um marcador de tradução, e os nossos resultados mostram que o FGF22 induziu um aumento na tradução intra-axonal. Além disto, quando inibidores da tradução estão presentes no compartimento axonal, a diferenciação pré-sináptica induzida por FGF22 é abolida, demonstrando que a presinaptogénese induzida por FGF22 é dependente da síntese proteica local. Por fim, os nossos resultados demonstram que a diferenciação pré-sináptica induzida pelo FGF22 tem uma componente dependente da transcrição, pois a actinomicina D, um inibidor da transcrição, bloqueia parcialmente o efeito presinaptogénico do FGF22. Estes resultados revelam um novo papel para a síntese proteica local no desenvolvimento neuronal e pode potencialmente levar à identificção de novas moléculas envolvidas na formação sináptica.

Neurons are highly specialized cells that receive, process and transmit information to other cells. For many years, and until the discovery of polyribosomes in the base of dendritic spines, the predominant idea was that all proteins were translated in the cell body and then transported to the neurites. However, this canonical view has been challenged in the last decade and presently it is well established that local protein synthesis occurs in dendrites. Local translation in dendrites has been object of intense studies and is of particular importance in synaptic plasticity, namely during LTP and LTD. In contrast, axonal protein synthesis is still poorly understood. Surprisingly, recent studies identified a large number of mRNAs localized at distal axons and growth cones, suggesting that intra-axonal translation may play an important role in different steps of neuronal development. In line with these evidences, early studies in axons demonstrated the requirement of local translation during axon chemotrophic responses to guidance cues. Moreover, was demonstrated that local protein synthesis is required for other neurodevelopmental mechanisms, such as axonal outgrowth, axon responsiveness, neuronal survival and axon regeneration. Recent studies in the model organism Aplysia suggest that local translation might be important for synaptogenesis, as clustering of mRNAs and proteins at sites of synaptic contacts was observed. Interestingly, it was also observed in Aplysia that synapse formation induces the transcription of sensorin mRNA. However, sensorin has no mammalian homologue and the relevance of these observations to mammalian model systems remains elusive. In this work we investigated the requirement of local protein synthesis in presynaptic differentiation. Using FGF22, a presynaptic organizing molecule, and a novel platform, a microfluidic chamber system which allows the physical separation of axons from cell bodies and dendrites, we were able to specifically manipulate axons without the cell body contribution. Using primary cultures of rat embryonic hippocampal neurons in microfluidic devices we specifically stimulated distal axons with FGF22 and determined the “hot spots” of axonal mRNA translation. For that we evaluated the levels of p-4E-BP1, a translation marker, and our results show that FGF22 induced an increase in intra-axonal translation. Moreover, when translational inhibitors were present in the axonal compartment, FGF22-induced presynaptic differentiation effect was abolished, demonstrating that FGF22-induced presynaptogenesis is dependent on local protein synthesis. Lastly, our data demonstrates that presynaptic differentiation induced by FGF22 has transcriptional-dependent component, since actinomycin D, a transcriptional inhibitor, partially blocked FGF22 presynaptogenic effect. These results unraveled a novel role for axonal protein synthesis in neuronal development and can potentially lead to the identification of new molecules involved in synapse formation.