BDNF-induced local protein synthesis at the synapse: a regulatory role for hnRNPK

Abstract

A força da comunicação sináptica pode ser alterada de forma dinâmica em resposta a alterações da actividade neuronal, e pensa-se que esta plasticidade seja responsável pela formação de memórias e pela aprendizagem. A potenciação sináptica de longa duração (LTP) envolve dois tipos diferentes de mecanismos: as alterações iniciais dependem de modificações pós-traducionais de proteínas pré- e pós-sinápticas, enquanto as respostas mais tardias são mediadas por síntese proteica local e modificações na expressão de genes. O transporte dos mRNA sintetizados de novo do núcleo para as dendrites, de modo a permitir a síntese local de proteínas, é realizado por grânulos de RNA que estabilizam os transcritos. Estes grânulos desagregam-se em resposta à estimulação sináptica e pensa-se que estas alterações estão associadas à libertação dos mRNA para subsequente síntese local de proteínas. Esta síntese de proteínas na sinapse é particularmente importante para a manutenção da LTP. O acoplamento entre a actividade neuronal e a estimulação da síntese proteica na sinapse sugere que a interacção entre as proteínas que ligam ao RNA e os transcritos é regulada por mecanismos de sinalização intracelular. A neurotrofina BDNF e o factor de crescimento PDGF desempenham um papel importante na LTP. Os receptores TrkB e PDGF-β, que são activados por BDNF e PDGF, respectivamente. activam vias de sinalização comuns, incluindo a PI3-K/Akt, a Ras / ERK e a da PLCγ. Foi demonstrado que os receptores TrkB são capazes de activar a maquinaria de tradução, contribuindo para a fase dependente de síntese proteica da LTP (Santos et al., 2010). Este trabalho teve como objectivo identificar o papel de uma proteína que liga RNA, a hnRNPK, na síntese proteica nas dendrites de neurónios do hipocampo em cultura. Tendo em conta as evidências indicando a interacção desta proteína com RNAm que codificam proteínas com importância ao nível da plasticidade sináptica, investigámos também os efeitos do BDNF e do PDGF, os quais interagem com receptores distintos, na modulação desta interacção ao nível da sinapse. A síntese de proteínas foi estudada utilizando a técnica de percepção de tradução superficial (SUnSET) recentemente descrita (Schmidt et al., 2009). Quando a hnRNPK foi sobre-expressa em células COS-7 observou-se uma diminuição da síntese proteica, enquanto a co-transfecção com TrkB aumentou a tradução. Resultados preliminares sugerem que a redução dos níveis da hnRNPK em neurónios do hipocampo em cultura, usando um shRNA específico, atenua o aumento da síntese proteica ao nível das dendrites induzido pela estimulação com BDNF. Estes resultados sugerem que a hnRNPK desempenha viii um papel importante no transporte e/ou na entrega dos mRNA que são traduzidos nas dendrites em resposta à estimulação com BDNF. Neste trabalho investigámos também o efeito do BDNF na regulação da interacção da hnRNPK com mRNA que codificam proteínas importantes para a plasticidade sináptica, em sinaptoneurossomas, e os resultados obtidos foram comparados com o efeito do PDGF que também activa receptores acoplados a cinases de resíduos de tirosina. A presença de receptores funcionais para BDNF e PDGF em sinaptoneurossomas isolados a partir do hipocampo de rato foi confirmada por western blot, usando anticorpos contra a forma fosforilada da Akt, ERK 1 e ERK2. Os dados provenientes do PCR de transcrição reversa quantitativa mostrou a presença dos transcritos de GluA1, GluN1 e BDNF em imunoprecipitados da hnRNPK preparados a partir de sinaptoneurossomas de hipocampo, sugerindo que a proteína está envolvida no transporte destes transcritos ao longo das dendrites. Porém, a estimulação dos sinaptoneurossomas com BDNF reduziu a interacção dos transcritos com a hnRNPK, enquanto o PDGF aumentou a interacção dos mRNA para o GluA1 e GluN1, e não teve qualquer efeito nos transcritos para o BDNF. Estes resultados apoiam uma função para o BDNF na fase tardia da LTP, como promotor da libertação de mRNA associados à hnRNPK, o que poderá permitir que estes sejam traduzidos localmente. No caso do PDGF também regular a tradução ao nível da sinapse os mecanismos envolvidos serão certamente distintos.

The synaptic strength is known to respond to neuronal activity in a dynamic manner, and changes in neuronal connectivity are thought to underlie learning and memory formation. Long-term synaptic potentiation (LTP) involves two different types of mechanisms: the initial changes depend on posttranslational modifications of existing synaptic proteins whereas the delayed responses are mediated by local protein synthesis in dendrites and modifications in gene expression. The transport of newly synthesized mRNAs from the nucleus to dendrites, to allow local protein synthesis, is conducted by RNA granules that are responsible for the delivery and stabilization of transcripts. These granules are disassembled in response to synaptic stimulation and this is thought to release the mRNAs for subsequent local protein synthesis. Accordingly, local translation at the synapse is induced by neuronal activity, playing an important role in the maintenance of LTP. The coupling between neuronal activity and local protein synthesis suggests that the interaction of RNA binding proteins and the transcripts is regulated by intracellular signaling mechanisms. The neurotrophin BDNF and the growth factor PDGF were both shown to enhance LTP. TrkB and PDGF-β receptors, activated by BDNF and PDGF respectively, share several parallel signaling pathways, including the PI3-K/Akt, the Ras/ERK and the PLCγ pathways. TrkB receptors have been shown to activate the translation machinery contributing to the protein synthesis-dependent phase of LTP (Santos et al., 2010). In this work we aimed at characterizing the role of the RNA binding protein hnRNPK in the regulation of global protein synthesis in dendrites. Furthermore, given the evidence indicating that hnRNPK interacts with transcripts coding for proteins relevant for synaptic plasticity, we investigated the effects of BDNF and PDGF, which target distinct receptor tyrosine kinases, in the modulation of this interaction at the synapse. Protein synthesis was studied using the recently described surface sensing of translation (SUnSET) method (Schmidt et al., 2009). Overexpression of hnRNPK in COS-7 cells decreased total protein synthesis, but cotransfection with TrkB enhanced protein synthesis. Preliminary experiments indicated that hnRNPK knock-down in cultured hippocampal neurons with a specific shRNA downregulated the BDNF-induced increase in translation activity in dendrites. This suggests that hnRNPK plays an important role in the delivery and/or supply of mRNAs that are translated at the synapse in response to stimulation with BDNF. The effect of BDNF in the regulation of the interaction of hnRNPK with transcripts relevant for synaptic plasticity was investigated in hippocampal synaptoneurosomes, and the results were compared with the effect of PDGF which activates a different receptor tyrosine kinase. The presence of functional receptors for both ligands in hippocampal synaptoneurosomes was confirmed by the activation of the ERK and Akt signaling pathways, as determined by western blot with phospho-specific antibodies. Quantitative reverse-transcription PCR experiments showed that GluA1, GluN1 and BDNF transcripts co-immunoprecipitated with hnRNPK from hippocampal synaptoneurosomes, suggesting that the protein is involved in the transport of those transcripts. However, while stimulation of synaptoneurosomes with BDNF decreased the interaction of the transcripts with hnRNPK, PDGF increased the interaction of GluA1 and GluN1 mRNA with the ribonucleoprotein, and was without effect on the binding of BDNF transcripts. These evidences support a role for BDNF in the late phase of LTP by promoting the release of the transported mRNAs associated with hnRNPK, which should allow them to be locally translated. If PDGF proves to induce local protein synthesis at the synapse, distinct mechanisms may be involved.