Avaliação do biossensor DerBac como biossensor de cromato em solos

Abstract

O rápido desenvolvimento da indústria como a do papel, de fertilizantes e pesticidas, de baterias, de curtumes, de ferro e aço, leva a que grandes quantidades de metais pesados sejam descarregadas no meio ambiente constituindo uma grave fonte de contaminação. Ao contrário dos contaminantes orgânicos, os metais pesados não são biodegradáveis e tendem a acumular-se nos organismos vivos, sendo tóxicos e carcinogénicos. O crómio hexavalente é um metal pesado que apresenta elevada solubilidade, mobilidade e biodisponibilidade estando, por isso, associado a diversas patologias como reações alérgicas, dermatites de contacto, cancro de pulmão. De forma a prevenir a dispersão da poluição é importante conseguir detectar concentrações de cromato presente nos solos, na água e no ar. Deste modo, o objetivo deste trabalho consistiu em testar um sistema de biossensores capazes de detectar o crómio hexavalente em solução aquosa através da determinação da sua especificidade e sensibilidade e determinar a sua utilidade na deteção de cromato em solos correlacionando com os níveis de ecotoxicidade do solo. Numa primeira fase, procedeu-se à otimização das condições de crescimento das construções bacterianas pCHRGFP1 E. coli e pCHRGFP2 O. tritici e das condições de quantificação do cromato. Os resultados mostraram que os biossensores tiveram melhor funcionamento quando cultivados em meio LB e seguidamente mantidos em meio MMT suplementado com 0,3% de glucose. Em relação às condições de quantificação obteve-se melhores resultados, quando se utilizou comprimento de onda de excitação de 475 nm, em microplacas de 96 poços transparentes, após 5 horas de incubação. A partir destes resultados traçou-se a curvas de calibração para os dois biossensores (r =0,99). Posteriormente, otimizou-se as condições de extração e quantificação do cromato dos dois solos. Verificou-se que a recuperação do cromato introduzido no solo era máxima após três horas de agitação a 250 rpm, 25ºC. Testou-se a capacidade dos biossensores em quantificar o crómio hexavalente presente em solo artificialmente contaminado com quantidades conhecidas de cromato proveniente da Escola Agrária de Coimbra (solo natural) e também em solo OCDE (solo artificial). Verificou-se que o desaparecimento do cromato no solo natural foi mais gradual e mais lento que no solo OCDE. Neste último, ao fim de sete dias a presença de cromato era praticamente nula. Determinou-se a dose máxima efetiva para o cromato (EC50) por testes ecotoxicológicos com colêmbolos para os dois solos. No solo natural a EC50 foi de 43,9 mg Cr(VI)/Kg do solo, enquanto no solo OCDE não foi possível determinar o seu valor dada a semelhança dos resultados de toxicidade para as diferentes concentrações de Cr(VI) medidas, todas elas muito baixas. Correlacionando, estes valores com os resultados obtidos pelos biossensores percebeu-se que para concentrações superiores à EC50, o desaparecimento do cromato é mais lento, o que pode ser devido à toxicidade exercida sobre a comunidade microbiana inibindo a sua capacidade em reduzir o cromato. A fim de confirmar os resultados da quantificação de cromato obtidos com base nos biossensores, todas as amostras foram Resumo analisadas pelo método colorimétrico da difenilcarbazida, normalmente usado na deteção de cromato em soluções aquosas. Contudo, visto que este método apresenta limitações quando aplicado em matrizes complexas, recorreu-se a um segundo método químico mais sensível (Método EPA 7199) para comprovar a especificidade e sensibilidade dos biossensores desenvolvidos. Com base em todos os resultados obtidos, concluiu-se que os biossensores pCHRGFP1 E. coli e pCHRGFP2 O. tritici são uma alternativa na deteção de cromato presente nos solos mais económica que o método EPA e sem as limitações do método colorimétrico.

The rapid development of the industry as paper industry, fertilizers and pesticides, batteries, leather, steel and iron leads to large amounts of heavy metals discharged into the environment, resulting in a serious source of contamination. Unlike organic contaminants, heavy metals are not biodegradable and tend to accumulate in living organisms, making it toxic and carcinogenic. The hexavalent chromium is a heavy metal that has a high solubility, bioavailability and mobility and is therefore associated with several diseases such as allergic reactions, contact dermatitis and cancer of the lung. In order to prevent the dispersion of pollution it is important to map the concentrations of chromate present in soil, water and air. The aim of this study was to test, by determining the specificity and sensitivity, a system of biosensors designed to detect and quantify hexavalent chromium in aqueous solution and determine their applicability in the detection and quantification of chromate in soils. First, we optimized the growth conditions of the biosensors pCHRGFP1 E. coli and pCHRGFP2 O. tritici and the conditions of measurement of chromate. The results showed that biosensors had better results when grown in LB medium and maintained on MMT medium supplemented with 0.3% glucose. Considering the conditions of measurement, the best results were obtained when using excitation wavelength of 47nm, 96 well with transparent microplates, after 5 hours of incubation. These conditions were used to construct the calibration curves for the two biosensors (r = 0.99). Later, the conditions of extraction and quantification of chromate of both soils were optimized. Chromate was maximally extracted from contaminated soils when incubated three hours with stirring at 250 rpm, 25 ° C. The ability of biosensors to quantify hexavalent chromium present in artificially contaminated soil from the Agraria School of Coimbra (natural soil) and OECD soil (artificial soil) was tested. The results showed that chromate disappear from the natural soil more gradually and slower than in OECD soil, and at the end of seven days the presence of chromate was almost zero. For ecotoxicological tests, the collembolan maximal effective dose EC50 was determined for both soils. In natural soil, the collembolan EC50 was 43.9 mg Cr (VI)/kg of soil, while in OECD soil was not possible to determine their value, because the chromate concentrations were very low and the results of collembolan survival were similar for different concentrations of Cr (VI). At chromate concentrations in the soil higher than the EC50, the disappearance of chromate was slower, which may be due to the toxicity exerted on the microbial community inhibiting its ability to reduce chromate. In order to confirm the results of chromate quantification obtained with the biosensors, all samples were analyzed using diphenylcarbazide, a standard colorimetric methodology used in the quantification of chromate in aqueous solutions. However since this method has limitations when applied to complex matrices, a second more sensitive chemical method (EPA Method 7199) was used to demonstrate the specificity and sensitivity of biosensors developed. With all these results, it was concluded that the biosensors pCHRGFP1 E. coli and pCHRGFP2 O. tritici are an alternative in the detection and quantification of chromate present in the soil more economic than the EPA method and without the limitations of the colorimetric method.