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Title: Análise haplotípica de mutações comuns no gene HFE associadas à Hemocromatose em Portugal
Authors: Toste, Sandra de Fátima Gomes 
Orientador: Abade, Augusto Manuel Elias
Manco, Licínio Manuel Mendes
Keywords: Hemocromatose Hereditária; HFE; p.C282Y; p.H63D; p.S65C; Portugal; África; Sobrecarga de ferro; Haplótipo; SNP
Issue Date: 2013
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: A Hemocromatose Hereditária (MIM: 235200) é uma doença autossómica recessiva caracterizada pelo aumento da absorção de ferro. Esta patologia é uma das doenças genéticas mais comuns entre os indivíduos de origem Europeia, e na maioria dos casos encontra-se associada a mutações no gene HFE. A fim de investigar os haplótipos associados às mutações c.845 G˃A (p.C282Y), c.187 C˃G (p.H63D) e c.193 A˃T (p.S65C) na população Portuguesa, foram estudados os polimorfismos no gene HFE, -1206G˃C / -467C˃G / IVS2(+4)T>C / IVS4(+48)G>A / IVS4(-44)T>C / IVS5(-47)G>A / Poli-A+5C˃T. Os sete SNPs foram analisados num total de 151 amostras de indivíduos, homozigóticos p.C282Y (n=11), heterozigóticos p.C282Y (n=19), homozigóticos p.H63D (n=20), heterozigóticos p.H63D (n=34), heterozigóticos compostos p.C282Y/p.H63D (n=17), heterozigóticos p.S65C (n=6), heterozigóticos compostos p.S65C/p.H63D (n=3) e indivíduos sem mutações comuns HFE (n=41). Foi ainda analisada uma amostra populacional de origem Africana (n=27) e comparada com uma amostra populacional de origem Portuguesa. A associação de SNPs e haplótipos à sobrecarga de ferro foi avaliada recorrendo a um estudo caso/controlo: 63 indivíduos adultos com níveis elevados de ferritina (> 300 ng/mL) (excluindo a presença da mutação p.C282Y e sem outras causas conhecidas para a sobrecarga de ferro), foram comparados com um grupo de 21 indivíduos adultos com níveis normais/baixos de ferritina (<100 ng/mL). Os SNPs foram genotipados por PCR-RFLP, e as análises estatísticas foram realizadas recorrendo aos programas Plink (http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/) e Arlequin v.3.11. A mutação p.C282Y foi encontrada associada aos haplótipos GCTGTGC (0,98) e CCTGTGC (0,02), ou apenas TTG para os polimorfismos IVS2(+4)T>C / IVS4(- 44)T>C / IVS5(-47)G>A, o mesmo haplótipo descrito nas restantes populações Europeias. Este resultado permite concluir que, em Portugal, a principal mutação causadora de hemocromatose do tipo HFE tem a mesma origem da mutação p.C282Y na Europa. À mutação p.H63D foram associados seis haplótipos: GCCGTAC (0,51), CGCGTAC (0,26), GGCGTAC (0,03), CCCGTAC (0,17), CGCGTAT (0,01) e CCCGTGC (0,02). Se considerarmos os polimorfismos IVS2(+4)T>C / IVS4(-44)T>C / IVS5(-47)G>A observam-se dois haplótipos, um idêntico ao encontrado nas restantes populações Europeias (CTA) e um segundo observado pela primeira vez numa população de origem Europeia (CTG). O facto de ter sido encontrado um haplótipo diferente associado à mutação p.H63D, sugere que a mutação p.H63D pode ter ocorrido uma segunda vez (mutação recorrente) na amostra populacional Portuguesa. Associados à mutação p.S65C (n=9) foram encontrados os haplótipos GCCGCAC (0,10), CCCGCAC (0,80) e CGCGCAC (0,10). Para os polimorfismos IVS2(+4)T>C / IVS4(- 44)T>C / IVS5(-47)G>A, a mutação p.S65C foi encontrada associada a um haplótipo único CCA, semelhante ao encontrado na população Russa mas diferente do haplótipo CTA, encontrado numa amostra populacional Francesa (Bretanha). O estudo dos polimorfismos numa população Africana (n=27) e numa amostra populacional Portuguesa de indivíduos normais (n=21) revelou uma distribuição de frequências semelhante, exceto para os polimorfismos -467C˃G e IVS5(-47)G>A, com distribuição de frequências alélicas inversa nas duas populações. O teste exato de diferenciação entre as duas populações com base nas frequências alélicas (incluindo a mutação p.H63D) mostrou um valor p significativo (p<0,001). No estudo de associação à sobrecarga de ferro, a mutação p.H63D (OR 2,75; p=0,012), e os alelos IVS2(+4)C (OR 3,64; p=0,003) e IVS5(-47)A (OR 0,34; p=0,002) foram encontrados associados positivamente à sobrecarga de ferro. Por sua vez, observa-se que os haplótipos CCCATGGTGC e GCCATGGTGC nos cromossomas normais, que incluem os alelos ancestrais IVS2(+4)T e IVS5(-47)G (sublinhados nos haplótipos), têm um efeito protetor relativamente à sobrecarga de ferro (0,162 e 0,155, respetivamente, no grupo controlo vs. 0,008 e 0,035, respetivamente, em indivíduos com níveis elevados de ferritina) (p=7,13x10-5 e p=0,0081, respetivamente) e o haplótipo GCGACGGTAC, com a mutação c.187C˃G (p.H63D) (sublinhada no haplótipo), está associado ao aumento da sobrecarga de ferro (0,066 no grupo controlo vs. 0,241 em indivíduos com níveis elevados de ferritina) (p=0,015).
Hereditary Hemochromatosis (MIM: 235200) is an autosomal recessive disease characterized by increased iron absorption. This pathology is one of the most common genetic diseases among individuals of European origin, and in most cases is associated with mutations in the HFE gene. In order to investigate haplotypes associated with the major HFE mutations c.845 G˃A (p.C282Y), c.187 C˃G (p.H63D) and c.193 A˃T (p.S65C) in the Portuguese population, the following intragenic polymorphisms were studied: -1206G>C / - 467C>G / IVS2(+4)T>C / IVS4(+48)G>A / IVS4(-44)T>C / IVS5(-47)G>A / Poli-A +5C>T. The seven SNPs were analyzed in a total of 151 samples from individuals homozygous p.C282Y (n=11), heterozygous p.C282Y (n=19), homozygous p.H63D (n=20), heterozygous p.H63D (n=34), compound heterozygous p.C282Y/p.H63D (n=17), heterozygous p.S65C (n=6), compound heterozygous p.S65C/p.H63D (n=3) and 41 individuals without these common HFE mutations. A population sample from African origin (n=27) was further examined and compared with a sample of Portuguese origin. The association of SNPs and haplotypes whit iron overload was evaluated using a case/control model: 63 adults with elevated serum ferritin levels (> 300 ng mL) (excluding carriers for the p.C282Y mutation and no other known causes for iron overload), were compared with a group of 21 healthy adults with normal/low ferritin levels (<100 ng / ml). The SNPs were genotyped by PCR-RFLP, and statistical analyzes were performed using the programs Plink (http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/) and Arlequin v.3.11. Mutation p.C282Y was found associated with haplotypes GCTGTGC (0.98) and CCTGTGC (0.02), or TTG for the polymorphisms IVS2(+4)T>C / IVS4(-44)T>C / IVS5(-47)G>A, the same haplotype that has been described in other European populations. This result shows that in Portugal, the main haemochromatosis HFE mutation has the same origin of the remaining mutation p.C282Y in Europe. For p.H63D mutation six haplotypes were found: GCCGTAC (0.51), CGCGTAC (0.26), GGCGTAC (0.03), CCCGTAC (0.17), CGCGTAT (0.01) and CCCGTGC (0.02). Considering polymorphisms IVS2(+4)T>C / IVS4(-44)T>C / IVS5(-47)G>A, two haplotypes were observed, one identical to that found in other European populations (CTA) and a second observed for the first time in a population from European origin IX (CTG). This different haplotype found associated with mutation p.H63D, suggests that mutation p.H63D may have occurred a second time (recurrent mutation) in the Portuguese population sample. Associated with mutation p.S65C (n=9) four haplotypes GCCGCAC (0.10), CCCGCAC (0.80) and CGCGCAC (0.10) were found. Regarding polymorphisms IVS2(+4)T>C / IVS4(-44)T>C / IVS5(-47)G>A, the mutation p.S65C was found associated with a single haplotype (CCA), similar to the one found in the Russian population but different from the CTA haplotype found in a French population sample (Brittany). The study of polymorphisms in the African population (n=27) and Portuguese population in a sample of normal subjects (n=21) showed a similar frequency distribution except for polymorphisms -467C>G and IVS5(-47)G>A that show inverse allele frequencies distribution in the two populations. The exact test of differentiation between the two populations based on allele frequencies (including the mutation p.H63D) showed a significant p-value (p<0.001). In the association study to iron overload, p.H63D mutation (OR 2.75, p = 0.012), and alleles IVS2(+4)C (OR 3.64, p = 0.003) and IVS5(-47)A (OR 0.34, p = 0.002) were found positively associated with iron overload. Regarding haplotypes it was observed that CCCATGGTGC and GCCATGGTGC haplotypes in normal chromosomes, that include the ancestral alleles IVS2(+4)T and IVS5(-47)G (underlined in haplotypes) have a protective effect on the iron overload (0.162 and 0.155, respectively, in the control group vs. 0.008 and 0.035, respectively, in subjects with elevated levels of ferritin) (p = 7,13 x10-5 and p = 0.0081, respectively). Haplotype GCGACGGTAC with the mutation c.187C>G (p.H63D) (underlined in the haplotype) is associated with increased iron overload (0.066 in control group vs. 0,241 in individuals with elevated levels of ferritin) (p = 0.015).
Description: Dissertação de mestrado em Biologia apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
URI: http://hdl.handle.net/10316/24720
Rights: openAccess
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