Lathyrus sativus L. : application of biotechnological and biochemistry techniques towards plant breeding

Abstract

O chícharo (Lathyrus sativus L.) é uma das culturas de grão que tem sido negligenciada (NUC), no entanto apresenta um elevado potencial para ser uma importante fonte de proteínas, principalmente em países com deficit alimentar, uma vez que consegue desenvolver-se em terrenos marginais inapropriados para outras culturas mais exigentes. Ademais, o chícharo pode ser um importante reservatório de diversidade genética, com características de elevado interesse, que poderá ser utilizado em programas de melhoramento vegetal. Apesar das enormes vantagens que o chícharo comporta, todo o seu potencial está ainda por realizar. Recentemente tem havido um renovado interesse nesta cultura, inclusive em Portugal, e algumas das mais modernas biotecnologias têm sido aplicadas no sentido de promover o melhoramento desta planta. O objetivo deste trabalho é a realização do um estudo de oito variedades tradicionais portuguesas abrangendo três diferentes, mas complementares, aspetos concomitantes com o melhoramento do chícharo: propagação através da cultura de tecidos, avaliação da diversidade genética e identificação e quantificação da neurotoxina β- ODAP. Colheram-se, junto dos produtores da região do Sicó, oito genótipos das variedades tradicionais. Foram estabelecidas culturas in vitro de ápices meristemáticos em meio MS suplementado com 1 μM BAP, não tendo sido observadas diferenças relevantes na resposta dos diferentes genótipos, contudo o genótipo LS2 foi o que apresentou melhores resultados. Numa segunda experiência foram testados explantes do genótipo (LS2) em meio de cultura com diferentes concentrações de BAP (0, 1, 2, 4, 8 e 10 μM), tendo sidos as concentrações de 2 e 10 μM a apresentar os melhores resultados (5.02 cm comprimento médio dos rebentos para 2 μM e 1,7 média de rebentos por explante para 10 μM). No que concerne ao enraizamento, explantes colocados em meio contendo 2,46 μM IBA e posteriormente transferidos para meio sem hormona, apenas alguns rebentos apresentaram a formação de raízes. Os dados resultantes do estudo de diversidade indicam que não existem diferenças geneticamente relevantes entre as variedades colhidas em Alvaiázere e Penela. A elevada diversidade genética apresentou um valor médio de 0,438, com o genótipo LS7 a refletir o valor mais alto (0,515) e o valor mais baixo (0,270) é atribuído ao genótipo LS4. Considerando os valores resultantes da AMOVA, a variância molecular é justificada pela diversidade intra variedades, entre os indivíduos (93,27%) e apenas 6,73% é atribuída às diferenças entre variedades. Foi utilizada a tecnologia de Ressonância Magnética Nuclear (NMR) para identificar e quantificar os níveis de β- ODAP existentes nas diferentes variedades. Os resultados da NMR mostram a quantidade de β- ODAP é similar nas oito variedades, variando num intervalo 0,366-0,572 ppm. LS3 possui o valor mais baixo (0,366) enquanto que o genótipo LS4 apresenta o mais elevado (0,572). Os resultados demonstraram que o β-ODAP é o único isómero presente nas amostras analisadas. A conversão deste isómero em β-ODAP requer ativação térmica de facto, submeter o grão de chícharo a uma temperatura de 100ºC durante 60 minutos pode reduzir os teores de β-ODAP em cerca de 56%.

Grass pea (Lathyrus sativus L.) is one of the pulse underutilized crops (NUC) that can provide an important source of rich-protein food, mainly in low-income food deficit countries, since it can thrive in marginal lands where modern crops are unable to grow. Moreover, L. sativus may be an important source of genetic diversity, with very interesting traits, which will be very useful for plant breeding programs. Despite the many advantages that grass pea presents, the full potential of L. sativus has not been realized. In recent years these has been a renewed interest on this crop, Portugal included, and some of the most recent biotechniques have been used to address the improvement of grass pea. The purpose of this work is to make a study of eight L. sativus Portuguese landraces addressing three different, yet complementary aspects of grass pea improvement: propagation through tissue culture; evaluation of genetic diversity and identification and quantification of the neurotoxin β- ODAP. Seeds of eight different genotypes of L. sativus landraces were collected from eight farms from Sicó region. Shoot tip cultures were established in vitro on a MS medium supplemented with 1 μM BAP. No differences were found in the response of the different genotypes. In a second experiment shoot tips from the best responding genotype (LS2) were tested on media containing different concentrations of BAP (0, 1, 2, 4, 8 and 10 μM) with 2 and 10 μM of this cytokinin giving the best results (5.02 cm average length of shoots in 2 μM and 1.7 average shoot per explants in 10 μM). Attempts to root the obtained shoots on a medium containing 2.46 μM IBA followed by transfer to an auxin-free medium only had little succeed with only a few shoots showing root formation. Data of the genetic diversity study indicate that no significant differences between the two collecting sample areas (Penela and Alvaiázere) were found. The high genetic diversity was on average 0.438, being the highest value (0.515) detected on LS7 population and the lowest (0.270) on LS4 population. Considering the result of the AMOVA most of the molecular variance detected is due to differences within populations (93.27 %) and only 6.73 % of the variance can be associated to differences among populations. A proton (1H) Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy was performed to identify and quantify the β- ODAP content among the different eight populations. The results of 1H-NMR analysis showed that the β-ODAP content is similar among the populations, ranging from 0.366-0.572 ppm. LS3 possesses the lowest content (0.366 ppm) while LS4 possesses the highest content (0.572). The results demonstrate that β- ODAP is the only isomer present in the samples of L. sativus. The conversion of this isomer into the β-ODAP requires thermal activation indeed boiling of the seed is able to reduce the levels of β-ODAP to almost 56% after heating for 60 minutes.