Role of selective kinases and GDNF on iron-mediated alpha-synuclein phosphorylation-relevance to Parkinson's disease

Abstract

A doença de Parkinson (PD, do inglês “Parkinson’s disease”) é uma patologia neurodegenerativa crónica e progressiva, caracterizada pela perda seletiva dos neurónios dopaminérgicos nigroestriatais. As manifestações clínicas desta doença neurodegenerativa incluem dificuldades motoras, instabilidade postural, bradicinésia, tremor de repouso, dificuldades na marcha e rigidez muscular. A evidência neuropatológica da doença é a intensa e progressiva perda dos neurónios dopaminérgicos que contêm neuromelanina na substantia nigra pars compacta (SNpc) e a presença de corpos de Lewy (LB), maioritariamente constituídos por α-sinucleína (α-syn, do inglês “α-synuclein”). Vários mecanismos têm sido propostos para explicar o processo neurodegenerativo nos neurónios nigroestriatais, incluindo a disfunção mitocondrial e o stresse oxidativo. Estudos anteriores demonstraram um aumento dos níveis de ferro (Fe) na SN de cérebros de doentes de Parkinson, implicando a ocorrência de stresse oxidativo no processo neurodegenerativo. Contudo, atualmente não existe um tratamento neuroprotetor efetivo para a PD. De acordo com a literatura, a agregação e o estado de fosforilação da proteína α-syn desempenham um papel importante na patogénese da PD. Alguns estudos demonstraram que a α-syn depositada nos LBs está altamente fosforilada no resíduo de serina (Ser)129 (quase 90% da α-syn), atribuindo um papel importante à fosforilação na agregação da α-syn e na formação dos LBs; contudo o seu papel na neurotoxicidade ainda permanece controverso. Um grupo de cinases parece ser responsável pela fosforilação da α-syn. Neste grupo de cinases estão incluídas as polo-like kinases (PLK1 e PLK2), casein kinases (CK-1 e CK-2) e a leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2). Por outro lado, evidências anteriores sugerem que o GDNF (do inglês “glialderived neurotrophic factor”) pode oferecer uma potencial proteção terapêutica contra esta doença. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o papel de tais cinases (através da sua inibição com compostos potencialmente seletivos) e do GDNF na regulação da fosforilação da Ser129 da α-syn em células expostas a Fe (um indutor do stresse oxidativo). Além disso, avaliámos o efeito dos inibidores, Fe e GDNF na toxicidade celular. Para tal, usámos células humanas derivadas de neuroblastoma, as células SH-SY5Y, que sobre-expressam de forma condicionada a α-syn wild-type (WT), através de um sistema de expressão Tet-Off regulado por doxiciclina (Dox). Os nossos resultados demonstraram que a sobre-expressão da α-syn despoletada na ausência da Dox, induziu um decréscimo na viabilidade celular, quando comparado com as células incubadas com Dox, avaliada pelo método de Alamar Blue. Estes resultados sugeriram que a produção anormal de α-syn é tóxica. Também mostrámos que, com a exceção dos inibidores das PLKs, concentrações nanomolares dos inibidores de cinases conduziram a uma percentagem aceitável de células viáveis. Além disso, a avaliação da integridade da membrana plasmática e da atividade da caspase-3 em células expostas aos inibidores seletivos, a FeSO4 (Fe, 500μM) e GDNF (20 ng/ml), não revelou efeitos citotóxicos significativos sobre as células, quando comparado com o respetivo controlo. Demonstrámos ainda que o GDNF induziu a ativação precoce da via de sinalização PI-3K/Akt, tal como demonstrado pelo aumento dos níveis de fosforilação da Akt 10 min após a incubação com GDNF. É interessante notar que, a exposição ao Fe ou GDNF durante 2 h aumentou os níveis de fosforilação da α-syn na Ser129. Contudo, a pré-incubação de GDNF preveniu a fosforilação da α-syn induzida por Fe. Esta observação sugere que o GDNF é importante para reduzir a fosforilação da α-syn induzida pelo stresse oxidativo. Por fim, a pré-incubação das células com os inibidores da LRRK2 ou CK-2 (em particular), seguido da exposição a Fe, impediu o aumento da fosforilação da α-syn induzida pelo Fe. Os resultados apresentados neste trabalho parecem indicar que a CK-2 está entre as potenciais cinases responsáveis pela fosforilação do resíduo de Ser129 da α-syn. Do mesmo modo, o GDNF parece ser capaz de contrariar o aumento da fosforilação da α-syn despoletado pelo Fe, o que pode depender da ativação da via de sinalização intracelular PI-3K/Akt. Tendo em conta que a fosforilação da α-syn parece desempenhar um papel importante na patogénese da doença, estas estratégias podem representar uma solução terapêutica promissora na PD

Parkinson’s disease (PD) is a chronic progressive neurodegenerative disorder which pathology is characterized by a profound and selective loss of nigrostriatal dopaminergic neurons. Clinical manifestations of this neurodegenerative disease include motor impairments, postural instability, bradykinesia, resting tremor, gait difficulties and rigidity. The neuropathological evidence of the disease are the progressive and intense loss of neuromelanincontaining dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc) and the presence of Lewy bodies (LB), mainly composed of α-synuclein (α-syn). Several mechanisms have been proposed to be implicated in the neurodegeneration of SNpc neurons, including mitochondrial dysfunction and oxidative stress. Previous studies have reported an increase in iron (Fe) levels in the SN of PD brains, implicating oxidative stress as an important process of cell fate. However, currently there is no neuroprotective effective treatment for PD. Previous evidences have shown that α-syn aggregation and phosphorylation states play an important role in PD pathogenesis. Some reports demonstrated that α-syn deposited in LBs is highly phosphorylated at serine (Ser)129 (almost 90% of α-syn), suggesting an important role for phosphorylation in α-syn aggregation and LB formation, although it is still debatable its role in neurotoxicity. A group of kinases have been suggested to be responsible for α-syn phosphorylation. These include polo-like kinases (PLK1 and PLK2), casein kinases (CK-1 and CK-2) and leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2). Moreover, previous evidences suggest that glial-derived neurotrophic factor (GDNF) may offer potential therapeutic protection in PD. Thus, the aim of this study was to evaluate the role of such kinases (through inhibition by potential selective compounds) and GDNF in regulating the phosphorylation of α-syn at Ser129 in cells subjected to Fe, an inducer of oxidative stress. In addition, we evaluated the effects of kinase inhibitors, Fe and GDNF on cell toxicity. For this purpose, we used SH-SY5Y human neuroblastoma cells conditionally overexpressing wild-type (WT) α-syn in a Tet-Off system regulated by doxycycline (Dox). Our results demonstrated that α-syn overexpression triggered by the absence of Dox led to a decrease in cell viability when compared to cells incubated with Dox, as assessed by Alamar Blue assay. This may suggest that an abnormal production of α-syn is toxic. We also showed that, with the exception of PLKs inhibitors, nanomolar concentrations of selected kinase inhibitors led to an acceptable percentage of viable cells. Moreover, assessment of plasma membrane integrity and caspase-3-like activity in cells exposed to the selected inhibitors, as well as FeSO4 (Fe, 500μM) and GDNF (20 ng/ml) did not reveal significant cytotoxic effects upon the cells, compared with respective control. We also were able to demonstrate that GDNF induced the early activation of PI-3K/Akt signaling pathway, as highlighted by increased levels of phosphorylated Akt 10 min after incubation with GDNF. Interestingly, exposure for 2 h with Fe or GDNF increased α-syn (Ser129) phosphorylation. However, pre-incubation of GDNF prevented Fe-induced α-syn phosphorylation state. This observation may suggest that GDNF is important for reducing α-syn phosphorylation induced by oxidative stress. Finally, preincubation of cells with inhibitors of LRRK2 or CK-2 (in particular) followed by Fe exposure largely precluded Fe-induced stimulation of α-syn phosphorylation. Data presented in this work seem to indicate that CK-2 is among potential kinases involved in α-syn phosphorylation at Ser129. Likewise, GDNF seems to be able to counteract increased α-syn phosphorylation evoked by Fe, which may largely depend on the activation of intracellular PI-3K/Akt signaling pathway. Because α-syn phosphorylation has been shown to play an important role in disease pathogenesis, these strategies may represent a promising therapeutic solution in PD.