Pesquisa de estirpes de Saccharomyces cerevisiae para expressão de proteína recombinante

Abstract

Recombinant DNA expression constitutes a major approach in gene function studies that naturally complement genetic and genomic research. Expression systems provide an invaluable tool for investigating the roles of novel gens, either in their original cellular environment or in specialized host organisms, to express high quantities of recombinant proteins for biochemical studies and structural determination, or even for industry applications or medical applications. Higher yield of proteins are achieved in prokaryotic systems and E. coli is the traditional host for producing recombinant protein. Its drawback of poor post-translational modifications when compared to a eukaryote organism, gave S.cerevisiae a chance to stand out as expression system. It’s well known genetics, influence on mankind’s economics and culture in beer wine and bread making during centuries, its GRAS status, fast and easy growth to high densities with low cost medium, along with its eukaryote machinery made it one of the most appreciated expression systems used today. Genetic engineering is one of the best tools to improve already existent strains, however yeast libraries harbour huge biodiversity with uncharacterized strains from witch much profit can be taken. New enzymes, new organic molecules and new strains with specific enhanced capacities can be lying in this libraries. In this project, S. cerevisiae library of wine and vineyeard strains was screened to discover and validate a S. cerevisiae expression strain. The screen was prepared first by assembling an expression vector with the pAMT20 shuttle vector as backbone, mus musculus salivary α-Amylase as reporter enzyme, KanMX4 as selection marker, and K. Lactis α-mating factor prepro peptide as secretion leader. Transformation was adapted and carried on in a high throughput manner to screen the library and activity seen as halos formed around colonies in agar plates supplements with starch. Two commercial lab strains were used as reference for protein production levels, and to do so, a large-scale expression in liquid medium was performed and protein purified from supernatant in various steps, and activity measured to set a threshold for later comparison with the yeast candidates selected from the library. From 400 strains, 3 candidates stood out the average and are serious candidates to proceed with validations as a strain to produce recombinant protein.

A expressão de ADN recombinante é uma abordagem abundantemente utilizada para estudar a função de genes complementando as áreas de investigação genética e genómica. Os sistemas de expressão representam ferramentas valiosas para investigar a função de novos genes, expressando-os em grandes quantidades, quer nos hospedeiros aos quais pertencem ou em sistemas heterólogos, para estudos de caracterização bioquímica, determinação de estrutura 3D, e ate para serem usados na indústria ou na área da medicina. Os sistemas procariotas como a tradicional E. coli produzem maiores quantidades de proteína recombinante mas apresentam algumas limitações nas modificações póstraducionais de proteínas. Face às limitações do sistema em E.coli, a S. cerevisiae destacou-se como sistema de expressão heteróloga simples e robusto que permitia modificações pós-traducionais em proteínas. Acresce ainda o facto de ser microrganismo que reúne imensa informação acerca do seu genoma, é usado como modelo de estudo de mecanismos eucariotas em diversas áreas da ciência, teve influência preponderante na cultura e economia humana durante seculos como a produção de pão cerveja ou vinho, o seu estatuto GRAS e o facto de atingir grandes densidades celulares de forma rápida e pouco dispendiosa tornou-o rapidamente num sistema robusto e de uso rotineiro no laboratório. A engenharia genética é uma ferramenta interessante para melhorar as características de algumas estirpes já existentes, no entanto existem outras estipes de leveduras que nunca foram vistas ou caracterizadas, que estão escondidas por de trás da enorme biodiversidade existente em bibliotecas criadas a partir do isolamento de estirpes no seu meio natural. Estas bibliotecas têm um potencial enorme para se descobrir por exemplo novas estirpes com capacidades peculiares e melhores, novas enzimas, novas moléculas orgânicas entre outras. Este projecto, tirou partido do facto de dispor de uma libraria de leveduras isoladas de mostos de vinho ao longo de vários anos, à qual se fez uma seleção de estirpes com capacidade de produzir proteína heteróloga a níveis superiores à média. Para esta selecção criteriosa construiu-se um vetor, baseado no pAMT20, contendo uma alfa amílase salivar de mus musculus que serviu proteína repórter de actividade das colonias recombinantes, a cassete KanMX4 que é uma marca de selecção que confere resistência ao antibiótico G418, e uma sequência do prepro peptído responsável pela secreção de uma feromona com origem no K. lactis. O protocolo de transformação foi ajustado para funcionar em larga escala, e os testes de actividade foram avaliados como o tamanho de halos formados por colonias transformadas em meio solido com amido. Duas colonias de laboratório foram usadas como controlos no que diz respeito à quantidade de proteína produzida. Para isso fez-se uma expressão em meio liquido em larga escala, e purificou-se a proteína recombinante do sobrenadante e mediu-se a actividade. Esta actividade serviria como patamar de expressão proteica para comprara mais tarde com os níveis de produção de proteína recombinante de uma potencial estirpe isolada da biblioteca. De 400 estirpes evidenciaram se 4 estirpes que são fortes fortes candidatos para continuar para a fase de validação de estirpe para expressão de proteína heterologa