Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/24656
Title: Role of Metformin as co-adjuvant in anticancer therapy targeting Osteosarcoma Cancer Stem Cells
Authors: Oliveira, Daniela Isabel Paiva de 
Orientador: Gomes, Célia
Alpoim, Carmen
Keywords: Osteossarcoma; células estaminais cancerígenas; metformina; doxorrubicina; adjuvante
Issue Date: 2013
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: Background: Osteosarcoma (OS) is the most common malignant primary bone tumor that appears in childhood and adolescence. It was recently demonstrated that OS possesses a small population with stem-like features, CSCs, which are responsible for the heterogeneity and regenerative ability of tumor cells and are considered responsible for the resistance to conventional therapies, namely chemotherapy and radiotherapy. Metformin (METF) is one of the most prescribed drugs to treat type II diabetes and in the past decade METF gained special attention in cancer treatment because of its anticancer properties. In this study we propose to explore the potential role of METF as an adjuvant of doxorubicin (DOX) to target CSCs from OS, exploring the effects and signaling pathways underlying the anticancer properties of metformin on OS CSCs. Methods: CSCs were isolated from two human OS cell lines MNNG/HOS and MG-63 through the sphere–forming assay and then characterized regarding the expression of stem cell-specific transcription factors by immunofluorescence. The effects of MEFT on cell viability and proliferation was evaluated using the MTT and BrdU assays, respectively, and on sphere formation and self-renewal of CSCs. We also studied the chemosensitizing properties of METF on DOX cytotoxicity in both parental and corresponding CSCs. The metabolic state of cells following exposure to METF was assessed based on [18F]FDG uptake. The phosphorylated form of AMPK, which is the main target of METF and of mTOR were analysed by Western blot. Results: Both human OS cell lines MNNG/HOS and MG-63 contain sphere-forming cell subsets with stem-like properties expressing Oct4 and Nanog pluripotency markers, which are relatively more resistant to DOX than their differentiated counterparts. METF reduced the proliferation rate and viability of both cell types but was preferentially cytotoxic to CSCs relative to parental cells in a dose-dependent manner, and decreased the sphere-forming and self-renewal ability of both CSCs populations. Moreover, METF potentiate the cytotoxic effects of DOX in both cell populations, although the chemosensitizing effect has been more pronounced against CSCs. METF stimulates [18F]FDG uptake in parental differentiated cells but not in CSCs. Exposure to METF induced dose-dependent increase in AMPK activation, with a more pronounced effect in CSCs. Conclusion: MEFT demonstrated a preferential cytotoxicity against CSCs relatively to corresponding parental cells and inhibit the sphere-forming and self-renewal of CSCs. METF induce activation of AMPK and potentiates the cytotoxic effects of DOX mainly in CSCs. Collectively our results suggest that METF combined with DOX may be an effective treatment strategy for targeting CSCs in OS.
Introdução: Osteossarcoma (OS) representa o tumor ósseo primário mais comum aparecendo frequentemente na infância e adolescência. Recentemente foi demonstrada a presença de uma população com características de células estaminais em OS, as células estaminais cancerígenas (CSCs), que são consideradas responsáveis pela heterogeneidade e capacidade regenerativa das células tumorais. Para além disso, são também responsáveis pela resistência a terapias convencionais, como quimioterapia e radioterapia. Metformina (METF) é um dos fármacos mais prescritos no tratamento da diabetes tipo II. Na última década tem ganho especial atenção no tratamento contra o cancro devido às suas propriedades anticancerígenas. Neste estudo foi proposto explorar o papel da METF como adjuvante da doxorrubicina (DOX) tendo como alvo as CSCs de OS, para tal analisámos os efeitos e as vias de sinalização subjacentes às propriedades anticancerígenas da METF nestas CSCs. Métodos: As CSCs foram isoladas a partir das linhas humanas de OS MNNG/HOS e MG-63 pelo método de formação de esferas e posteriormente caracterizadas tendo em conta a expressão de fatores de transcrição específicos de células estaminais, por imunofluorescência. Os efeitos da METF na viabilidade e proliferação celulares foi avaliada através dos ensaios de MTT e BrdU, respetivamente, e na formação de esferas e auto-renovação das CSCs. Também foi analisado o efeito “chemosensitizing” da METF na citotoxicidade da DOX em CSCs assim como em ambas as linhas parentais. O estado metabólico das células após tratamento com METF parentais foi permitido pela análise de captação de [18F]FDG. A forma fosforilada de AMPK, que representa o principal alvo da METF e o mTOR foram analisados por Western Blot. Resultados: Ambas as linhas celulares de OS MNNG/HOS e MG-63 contém uma subpopulação de células com características de células estaminais que expressam marcadores de pluripotência, Oct4 e Nanog. METF, as quais sais são relativamente mais resistentes à DOX do que as células parentais. A METF reduziu a taxa de proliferação e viabilidade em ambos os tipos celulares mas foi preferencialmente citotóxico para as CSCs, sendo este efeito dependente da dose. Também diminuiu a capacidade de formação de esferas e a sua capacidade de auto-renovação. Para além disso, a METF potenciou o efeito citotóxico da DOX em ambas as populações celulares, embora esse efeito tenha sido mais pronunciado nas CSCs. METF aumentou a captação de [18F]FDG nas células parentais diferenciadas mas não nas CSCs. Exposição à METF induziu um aumento dependente da dose na ativação de AMPK, com um efeito mais pronunciado nas CSCs. Conclusão: A METF demonstrou uma citotoxicidade preferencial para as CSCs relativamente às células parentais para além de que diminuiu a formação de esferas e a sua capacidade de autorenovação. METF induziu a ativação de AMPK e potenciou os efeitos citotóxicos de DOX, principalmente nas CSCs. Em conjunto, os nossos resultados sugerem que o tratamento combinado de METF e DOX, pode ser uma abordagem eficaz na eliminação de CSCs no OS.
Description: Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
URI: http://hdl.handle.net/10316/24656
Rights: openAccess
Appears in Collections:FCTUC Ciências da Vida - Teses de Mestrado

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