Quantification of glucose turnover and Cori cycling in ATGL-knockout mice by [U- 13C6]glucose infusion and LC-MS/MS analysis of glucose 13C-isotopomers

Abstract

A patofisiologia de doenças metabólicas como a diabetes mellitus tipo II (T2DM) é caracterizada pela perda de sincronia entre a síntese e catabolismo de triacilgliceróis (TAG). A lipase adiposa de triacilglicerídeos (ATGL), uma enzima envolvida na hidrólise de TAGs, tem sido alvo de vários estudos de forma a compreender o seu papel na resistência à insulina. A razão para este aumento de interesse é o fato de os ATGL knock‐outs (ATGL‐/‐) terem demonstrado maior sensibilidade à insulina e tolerancia à glucose em comparação com ratinhos sem a delecção (WT). Apesar de eles não recorrerem a ácidos gordos armazenados como fonte de energia, estas características fazem dos ratinhos ATGL‐/‐ um modelo único para a melhor compreensão da relação entre o metabolismo de TAGs e a resistência à insulina. A taxa do turnover de glucose e reciclagem pelo ciclo de Cori é altamente suscetível tanto à sensibilidade a insulina como à disponibilidade de nutrientes. Sob condições normais de jejum, a maioria da glucose é reciclada pelo ciclo de Cori. No entanto, a maior dependência de glucose por parte dos ratinhos ATGL‐/‐, levou‐nos a colocar a hipótese de que estes ratinhos seriam mais dependentes da produção de glucose endógena (EGP) para fazer face a esta necessidade e que a glucose seria eliminada principalmente através da oxidação, resultando em menor reciclagem através do ciclo de Cori. Para estudar esta hipótese, os enriquecimentos de glucose de ratinhos ATGL‐/‐ e WT, infundidos com [U‐13C6]glucose, foram quantificados por análise de gotas de sangue (DBS) por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC‐MS/MS). Após o desenvolvimento e validação do método, a quantificação do enriquecimento da [U‐13C6]glucose precursora permitiu a determinação da taxa de EGP, enquanto a quantificação dos isotopómeros parcialmente marcados [1,2‐13C2]glucose e [1,2,3‐13C3]glucose, forneceram uma avaliação do ciclo de Cori. A análise da EGP e do metabolismo do ciclo de Cori entre ratinhos ATGL‐/‐ e wild‐type, revelou que as taxas de EGP eram tendencialmente mais baixas para ratinhos ATGL‐/‐, quando comparados com ratinhos wild‐type e que o ciclo de Cori contribuía quantitativamente para a EGP em ambos os grupos. Assim, estes dados não confirmam a hipótese de maior oxidação de glucose e ciclo de Cori reduzido em ratinhos ATGL‐/‐.

The pathophysiology of metabolic diseases such as type II diabetes mellitus (T2DM) is characterized by a loss of synchrony between triacylglycerols (TAG) synthesis and catabolism. The adipose triacylglyceride lipase (ATGL), an enzyme involved in TAGs hydrolysis, has been the target of several studies in order to understand its role in insulin resistance. The reason for this increasing interest is the fact that ATGL knock‐outs (ATGL‐/‐) have demonstrated to be more insulin sensitive and glucose tolerant in comparison to wild‐types. Even though they do not resort to stored fatty acids (FAs) as energy fuel, these characteristics make ATGL‐/‐ mice a unique model for the better understanding of the relationship between TAGs metabolism and insulin resistance. The rate of glucose turnover and recycling via the Cori cycle is highly susceptible to both insulin sensitivity and nutrient availability. Under normal fasting conditions, the majority of glucose is recycled via the Cori cycle. However, in the case of ATGL‐/‐ mice, since they are more dependent on glucose, it was hypothesized that these mice would be more dependent on endogenous glucose production (EGP) to meet this demand and that glucose would be disposed mainly through oxidation, resulting in less recycling via the Cori cycle. To study this hypothesis, glucose enrichments from ATGL‐/‐ mice and wild‐type mice, infused with [U‐13C6]glucose, were quantified by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC‐MS/MS) analysis of dried blood spots (DBS). After method development and validation, the quantification of the parent [U‐13C6]glucose enrichment allowed the determination of the rate of EGP, while the quantification of the partially labelled isotopomers [1,2‐13C2]glucose and [1,2,3‐13C3]glucose, provided a measure of the Cori cycle. Analysis of EGP and Cori cycle metabolism between ATGL‐/‐ and wild‐type mice revealed that EGP rates tended to be lower for ATGL‐/‐ mice compared to wild‐types and that the Cori cycle contributed quantitatively to EGP in both groups. Therefore, these data do not support the hypothesis of higher glucose oxidation and reduced Cori cycling in ATGL‐/‐ mice.