Please use this identifier to cite or link to this item:
https://hdl.handle.net/10316/24599
Title: | Impact of H9c2 Cardiomyoblast Differentiation on Isoproterenol Toxicity: Different Modulation of Signaling Pathways | Other Titles: | Influência do Estado de Diferenciação de Cardiomioblastos H9c2 na Toxicidade Induzida pelo Isoproterenol: Diferente Modulação de Vias de Sinalização | Authors: | Branco, Ana Filipa Roque | Orientador: | Oliveira, Paulo Santos, Maria Sancha |
Keywords: | isoproterenol; receptores β-adrenérgicos; vias de sinalização apoptóticas; mitocôndria; mioblastos H9c2; diferenciação | Issue Date: | 2012 | Place of publication or event: | Coimbra | Abstract: | The chronic exposure of cardiomyocytes to catecholamines is associated
with pathologic alterations. Stress conditions and tissue insults trigger
the activation of neurohormonal systems and catecholamine synthesis is
consequently increased. The binding of circulating catecholamines to
adrenergic receptors normally incurs in physiological responses that
comprises increasing contractile force, heart rate, metabolic activity,
among other effects that affect cardiac performance. However,
hyperadrenergic stimulation, resulting from sustained activation of β-
adrenergic receptors (β-AR), is thought to be directly involved in
cardiomyocyte apoptosis. Over-activation of specific signaling pathways
results in several cellular processes which lead to progressive
myocardium deterioration and contribute toward decompensated heart
failure.
In this regard, the present work addresses the mechanisms by which
cardiac cells respond to an overstimulation of β-AR according to their
differentiation state (i. e. embryonic/adult). For this objective, we used
the rat myoblastic H9c2 cell line which can be differentiated in adult
skeletal or cardiac muscle cells. The synthetic catecholamine
isoproterenol (ISO) was used to stimulate β-AR since its specificity
represents an advantage when compared with endogenous
catecholamines.
Our hypothesis is that β-AR over-stimulation results in different cell
fates depending on the differentiation stage of the cell. This approach is
relevant since most studies are conducted in H9c2 cells in their
undifferentiated state (embryonic) raising questions on its applicability
to cardiotoxicity studies.
Initial characterization of H9c2 differentiation was performed
concerning differences in terms of intrinsic cell defenses and signaling
pathways which may render cells more or less susceptible to ISO. The
alteration in cellular physiology during differentiation was strengthened
by gene array analyses showing up-regulation of mitochondrial
metabolism genes and genes encoding calcium transporters and
differentiation markers, in retinoic acid-differentiated H9c2 cells.
In what concern ISO-induced toxicity, the present work demonstrates
that undifferentiated cells have increased resistance to ISO, which can be
16
explained by increased anti-apoptotic proteins including Bcl-2 and BclxL
and intrinsic defense capacity such as MnSOD. Several stress
responses were increased in differentiated cells, including p66Shc, p53
and Bax, at the same with higher mitochondrial degeneration. This was
particularly seen by mitochondrial depolarization, loss of respiratory
complexes and oxidative stress, which was mostly observed in
differentiated H9c2 cells. Moreover, after ISO treatment, differentiated
H9c2 cells showed increased cAMP, cytosolic calcium accumulation,
cleavage of PARP and activation of caspase 3. Alterations in calcineurin
and p38-MAPK in undifferentiated and differentiated cells can also
account for the larger toxicity of ISO in the latter. Moreover, the increase
in pro-apoptotic proteins was not accompanied in increased antiapoptotic
counterparts, as occurred in undifferentiated myoblasts (BclxL,
Bcl-2). We conclude that H9c2 cells present differential regulation
of stress responses during their differentiation which impact the toxicity
of several agents.
In conclusion, the present thesis demonstrates that undifferentiated and
differentiated H9c2 cells possess different susceptibility to the β-AR
agonist ISO in which the balance between pro- and anti-apoptotic
pathways are involved. The results are relevant from a basic toxicology
point of view, since this cell line is very used as a model for cardiac
cells. Furthermore, the data supplies evidence that the H9c2 cell line can
be used as a framework to investigate developmental cardiotoxicity. A exposição crónica de cardiomiócitos a catecolaminas está associada a alterações patológicas. Condições de stress e lesões no tecido cardíaco activam sistemas neurohormonais que induzem a consequente síntese de catecolaminas. A interacção de catecolaminas com receptores adrenérgicos induz respostas fisiológicas como o aumento da força de contracção muscular, aumento da actividade metabólica, entre outros efeitos que afectam o desempenho cardíaco. Contudo, a estimulação adrenérgica resultante de uma activação prolongada de receptores β-adrenérgicos (β-AR) pode estar directamente envolvida na apoptose de cardiomiócitos contribuindo para insuficiência cardíaca descompensada. A sobre-activação de vias de sinalização específicas resulta na estimulação de vários processos celulares que conduzem á deterioração progressiva do miocardio. Neste sentido, o presente trabalho pretende investigar os mecanismos pelos quais células cardíacas respondem à sobre-activação de β-AR segundo o seu estado de diferenciação (embrionário/adulto). Com este objectivo, usamos a linha celular mioblastica de rato H9c2 que tem a capacidade de ser diferenciada em células musculares esqueléticas e cardíacas. A catecolamina sintética isoproterenol (ISO) foi usada no sentido de estimular β-AR já que a sua especificidade representa uma vantagem quando comparada com o uso de catecolaminas endógenas. A nossa hipótese de trabalho é que a sobre-activação de β-AR resulta em diferentes respostas dependendo do estado de diferenciação celular. Dado que a maior parte dos estudos conduzidos em células H9c2 usa esta linha celular no seu estado indiferenciado (embrionário), questões relativas á sua aplicabilidade em estudos cardiotóxicos levantam algumas dúvidas. A caracterização inicial do processo de diferenciação de H9c2 foi realizada tendo em conta diferenças em termos de defesas celulares intrínsecas e vias de sinalização que poderão induzir maior ou menor sensibilidade das células ao ISO. A alteração de processos fisiológicos nas células foi ainda investigada através de análise genética mostrando que genes envolvidos no metabolismo mitocondrial, na differenciação 18 celular e na codificação de transportadores de cálcio, estão sobreexpressos em células H9c2 diferenciadas em presença de ácido retinóico. O presente trabalho demonstra que células indiferenciadas apresentam maior resistência ao ISO, o que pode ser explicado pelo aumento de proteinas anti-apoptóticas tais como Bcl-2 e Bcl-xL, e na capacidade de defesa intrínseca tais como MnSOD. Múltiplas respostas a condições de stress encontram-se aumentadas em células diferenciadas, incluíndo proteinas p66Shc, p53 e Bax bem como degeneração mitocondrial. Esta última, identificada através da despolarização mitocondrial, perda de complexos respiratórios e stress oxidativo, que foi maioritariamente observado em celulas H9c2 diferenciadas. Após tratamento com ISO, em células H9c2 diferenciadas verifica-se um aumento de cAMP, acumulação de cálcio no citosol, clivagem da PARP e activação de caspase-3. As alterações nas proteínas calcineurina e p38-MAPK nas células indiferenciadas e diferenciadas podem também contribuir para uma maior toxicidade ao ISO nas últimas. O aumento de proteínas proapoptóticas não foi acompanhado por um concumitante aumento de próteinas anti-apoptóticas, como verificado em células indiferenciadas (Bcl-xL e Bcl-2). Concluímos que as células H9c2 apresentam uma regulação diferencial em resposta a condições de stress durante a sua diferenciação o que influencia a toxicidade de agentes cardiotóxicos. Em conclusão, o presente trabalho demonstra que células H9c2 indiferenciadas e diferenciadas possuem diferente susceptibilidade ao agonista de β-AR, ISO, sendo neste processo, o balanço entre proteínas pro- e anti-apoptóticas de grande importância. Os resultados são relevantes do ponto de vista toxicológico básico já que esta linha celular é normalmente utilizada como modelo para células cardíacas. Os resultados obtidos evidenciam que a linha celular H9c2 poderá ser utilizada em estudos que visam investigar a resposta cardiotóxica a fármacos, no entanto, há que ter presente que diferentes estados de diferenciação poderão influenciar diferentes susceptibilidades a vários agentes. Além disso, os resultados evidenciam que a linha H9c2 pode ser usada (como ferramenta) para investigar a cardiotoxicidade durante o desenvolvimento. |
Description: | Tese de doutoramento em Biologia, especialidade em Biologia Celular apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra | URI: | https://hdl.handle.net/10316/24599 | Rights: | openAccess |
Appears in Collections: | FCTUC Ciências da Vida - Teses de Doutoramento |
Files in This Item:
File | Description | Size | Format | |
---|---|---|---|---|
Tese_Ana Branco.pdf | 9.25 MB | Adobe PDF | View/Open |
Page view(s) 20
787
checked on Oct 15, 2024
Download(s) 50
693
checked on Oct 15, 2024
Google ScholarTM
Check
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.