Please use this identifier to cite or link to this item: https://hdl.handle.net/10316/24494
Title: Drug discovery of new anti-inflammatory phitochemicals using in vitro bio-guided assays : the case study of cymbopogon citratus
Authors: Francisco, Vera Lúcia Gomes 
Orientador: Batista, Maria Teresa Pereira Marques
Rosete, Maria Teresa de Teixeira Cruz
Issue Date: 31-Jul-2013
Citation: FRANCISCO, Vera Lúcia Gomes - Drug discovery of new anti-inflammatory phitochemicals using in vitro bio-guided assays : the case study of cymbopogon citratus. Coimbra : [s.n.], 2013. Tese de doutoramento
Abstract: Inflammation is a complex immunological process involved in protection against infection or injury tissue and homeostasis maintenance that when dysregulated leads to a chronic inflammation state and disease, including Alzheimer, diabetes, cardiovascular diseases, atherosclerosis and cancer. However, given that the current anti-inflammatory drugs are not totally safe and effective; there is the need to develop new anti-inflammatory agents. The inflammatory response comprises inducers, being a classical one the bacterial lipopolysaccharide (LPS), the sensors expressed in the inflammatory cells, signaling transduction pathways that induce the expression of inflammatory genes, and effectors. Macrophages are key inflammatory cells that provide an innate immune defense against foreign agents and also promote an adaptative immune response by the secretion of several inflammatory mediators, which expression is controlled by intracellular signaling pathways. Therefore, compounds targeting signal transduction pathways and mediators produced by macrophages stimulated with an inflammatory stimulus can act as anti-inflammatory, and consequently, can be potential therapeutic agents. In the last decades, many identified drug leads and new drugs launched in the market have been derived from natural products. Traditional medicinal herbs have long been used as remedies against inflammatory-related diseases. Moreover, phenolic compounds are secondary metabolites of plants with well known healthy effects, namely antioxidant, cardio- and neuro-protection, anti-cancer and anti-inflammatory. Thus, the study of phenolic content in medicinal plants is extremely relevant in the search of new anti-inflammatory drugs. This work aimed to identify in the medicinal plant Cymbopogon citratus (DC.) Stapf (Cy) phenolic compounds with an anti-inflammatory potential and to investigate their mechanisms of action, through in vitro bio-guided assays. A lipid- and essential oil-free infusion of Cy leaves was prepared and its anti-inflammatory properties were evaluated in LPS-stimulated human and murine macrophages. The production of several pro-inflammatory mediators, namely nitric oxide (NO) and prostaglandin (PG) E2 in RAW 264.7 murine macrophages, as well as tumor necrosis factor (TNF)-α and chemokine (C-C motif) ligand (CCL) 5 in human macrophages were inhibited by Cy extract (1.115 mg/mL). Its anti-inflammatory activity was correlated with the inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) and c-jun NH2-terminal kinase (JNK) 1/2 signaling pathways. Moreover, it was verified, for the first time, that Cy extract inhibited the chymotrypsin-like activity of proteasome, with the consequent inhibition of the nuclear factor (NF)-kB, a transcription factor that regulates the expression of numerous inflammatory mediators. Cy extract was fractionated by column chromatography and polyphenol-rich fractions, namely phenolic acids (PAF yield of 23.8%, w/w, of Cy extract), flavonoids (FF; yield of 4.4%, w/w, of Cy extract) and tannins (TF; yield of 3.5%, w/w, of Cy extract) were obtained. Data revealed that PAF and TF were partially responsible by Cy anti-inflammatory properties through the inhibition of NF-kB activation, NO production, the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and TNF-α. In turn, flavonoids decreased TNF-α and iNOS expression but not NO production. Among the three fractions, PAF strongly contributed to the inhibition of proteasome activity triggered by Cy extract. Chemical characterization by HPLC/PDA/ESI-MSn identified chlorogenic acid (CGA) as the main phenolic acid of the Cy extract, which was partially responsible for the inhibitory effect on the proteasome activity. Therefore, Cy polyphenols, in particular CGA, were highlighted as bioactive compounds. Flavonoids of Cy were further characterized by proton nuclear magnetic resonance spectroscopy, O-, C- and O,C-glycosides of luteolin being isolated and identified, namely luteolin 7-O-β-glucopyranoside and luteolin 6-C-β-glucopyranoside (isoorientin), consistent with previous studies, as well as luteolin 2”-O-rhamnosyl-C-(6-deoxy-ribo-hexos-3-ulosyl) (cassiaoccidentalin B), identified for the first time in Cy. The cytotoxicity and the anti-inflammatory properties of luteolin and its glycosides were evaluated in LPS-stimulated mouse macrophages. Luteolin glycosides demonstrated less cytotoxicity than luteolin aglycone, which could be an advantage from a pharmacological point of view due to the high toxicity of the current available ant-inflammatory drugs. To evaluate the anti-inflammatory potential of luteolin glycosides, the production of NO as well the expression of iNOS, interleukin (IL)-1β, IL-6 and TNF-α were analyzed. Data revealed that glycosylation decreased the luteolin anti-inflammatory activity, with a higher reduction for C-glycosylation than O-glycosylation. Taking into account the bioavailability and metabolism of luteolin glycosides, their in vivo administration should be considered. In conclusion, this work demonstrated the anti-inflammatory activity of Cymbopogon citratus (DC.) Stapf, using an in vitro bio-guided assay, which supports the traditional use of Cy leaves infusion. Furthermore, the molecular mechanisms responsible for the anti-inflammatory properties were elucidated and polyphenols, namely chlorogenic acid and luteolin glycosides, were pointed out as bioactive compounds, encouraging in vivo validation studies with the ultimate goal of developing a new anti-inflammatory drug.
A inflamação é um processo imunológico complexo envolvido na proteção contra a infeção ou dano tecidular e na manutenção da homeostasia e que, quando desregulado predispõe o hospedeiro para o desenvolvimento de inflamação crónica associada a várias patologias, tais como Alzheimer, diabetes, doenças cardiovasculares, aterosclerose e cancro. No entanto, os fármacos anti-inflamatórios atualmente disponíveis não são totalmente seguros e eficazes, pelo que o desenvolvimento de novos fármacos anti-inflamatórios assume grande relevância. A resposta inflamatória é composta por indutores, tal como o lipopolissacarídeo (LPS), sensores que são expressos nas células inflamatórias, vias de sinalização intracelular que induzem a expressão de genes inflamatórios e moléculas efetoras. Os macrófagos são células inflamatórias que se destacam por proporcionarem uma defesa imediata contra agentes estranhos ao organismo e promoverem uma resposta imune adaptativa através da produção de mediadores inflamatórios, cuja expressão é controlada por vias de sinalização intracelular. Assim, compostos que têm como alvo as vias de sinalização e a produção de mediadores inflamatórios em macrófagos ativados, possuem potencial anti-inflamatório e, consequentemente, valor terapêutico. Nas últimas décadas, a maior parte dos farmacóforos identificados e dos novos medicamentos derivaram de produtos naturais. Várias plantas usadas em medicina tradicional são utilizadas no tratamento de patologias associadas à inflamação. Além disso, os compostos fenólicos são metabolitos secundários das plantas que possuem vários efeitos terapêuticos, tais como, antioxidantes, cardio- e neuro-protetores, anticancerígenos e anti-inflamatórios. Assim, o estudo de compostos fenólicos presentes em plantas medicinais é extremamente relevante na pesquisa de novos fármacos anti-inflamatórios. O objetivo deste trabalho foi identificar compostos fenólicos de planta medicinal Cymbopogon citratus (DC.) Stapf (Cy), com potencial anti-inflamatório e dissecar os seus mecanismos de ação, utilizando ensaios in vitro bio-guiados. Preparou-se uma infusão a partir das folhas de Cy, sem óleos essenciais e lípidos, e as suas propriedades anti-inflamatórias foram testadas em macrófagos estimulados com lipopolissacarídeo (LPS). A produção de mediadores inflamatórios, tais como monóxido de azoto (NO) e prostaglandina (PG) E2, em macrófagos de ratinho (RAW 264.7), bem como o fator de necrose tumoral (TNF)-α e a quimiocina CCL 5, em macrófagos humanos, foram inibidos pelo extrato de Cy (1,115 mg/mL), estando esta atividade relacionada com a inibição da ativação da p38 MAPK e da JNK 1/2. Além disso, verificou-se, pela primeira vez, que este extrato inibe a atividade quimiotripsina do proteassoma, com consequente inibição do NF-kB, um fator de transcrição que regula a expressão de mediadores inflamatórios. O extrato de Cy foi fracionado por cromatografia em coluna obtendo-se frações ricas em polifenóis, nomeadamente os ácidos fenólicos (PAF), os flavonóides (FF) e os taninos (TF). Os resultados obtidos demonstram que PAF e TF são parcialmente responsáveis pelas propriedades anti-inflamatórias do Cy por inibirem a produção de NO, expressão da sintetase do monóxido de azoto (iNOS) e do TNF-α, bem como o NF-kB. Os flavonóides diminuem a expressão de TNF-α e iNOS mas não a produção de NO. Das três frações, PAF contribuiu consideravelmente para a inibição da atividade do proteassoma verificada no extrato do Cy. A caracterização química, realizada por HPLC/PDA/ESI-MSn, permitiu identificar o ácido clorogénico (CGA) como o principal ácido fenólico do extrato, sendo parcialmente responsável pela inibição da atividade do proteassoma. Desta forma, os polifenóis de Cy, em particular o CGA, foram identificados como compostos bioativos. Os flavonóides do Cy foram caracterizados por espectroscopia de ressonância magnética nuclear de protão, sendo identificados e isolados O-, C- e O,C-glicósidos de luteolina, nomeadamente a luteolina-6-C-β-glucopiranósido (isoorientin), a luteolina-7-O-β-glucopiranósido e a luteolina 2"-O-ramnosil-C-(6-desoxi-ribo-hexos-3-ulosil) (cassiaoccidentalina B), sendo o último identificado pela primeira vez no Cy. A citotoxicidade e as propriedades anti-inflamatórias da luteolina e dos seus glicósidos foram avaliadas em macrófagos RAW 264.7 estimulados com LPS. Os glicósidos de luteolina demonstraram menor citotoxicidade do que a própria luteolina, o que pode constituir uma vantagem do ponto de vista farmacológico dada a elevada toxicidade dos anti-inflamatórios atualmente disponíveis no mercado. Para avaliar o potencial anti-inflamatório dos glicósidos de luteolina, foi analisa a produção de NO, assim como a expressão da iNOS, da interleucina (IL)-1β, IL-6 e do TNF-α. Os resultados demonstraram que a glicosilação diminui a atividade anti-inflamatória da luteolina, sendo esta redução maior para a C-glicosilação comparativamente com a O-glicosilação. No entanto, tendo em conta a biodisponibilidade e metabolismo dos glicósidos de luteolina, a sua administração in vivo deverá ser considerada e explorada. Em conclusão, este trabalho demonstra as propriedades anti-inflamatórias do Cymbopogon citratus (DC.) Stapf, utilizando um ensaio in vitro bio-guiado, o que suporta o uso desta planta em medicina tradicional. Além disso, foram elucidados os mecanismos moleculares responsáveis pelas propriedades anti-inflamatórias do Cy, tendo sido igualmente identificadas diversas moléculas bioativas, designadamente o ácido clorogénico e os glicósidos de luteolina. Estes resultados deverão ser validados in vivo tendo por objetivo final o desenvolvimento de um novo fármaco anti-inflamatório.
Description: Tese de doutoramento em Ciências e Tecnologia da Saúde, na especialidade de Biologia Celular e Molecular, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra.
URI: https://hdl.handle.net/10316/24494
Rights: openAccess
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