A Metabolic Switch for Cell Differentiation

Abstract

The potential application of stem cells as practical in vitro models for toxicological and pharmacological studies, or their prospective use in regenerative medicine converts them in a powerful instrument for the development of efficient therapies directed to a large array of pathologies. Responding to the active demand to obtain the necessary knowledge to explore this unique biological resource, a large body of literature has accumulated. This has resulted in a better understanding of some of the mechanisms that regulate stem cell properties, acting predominantly at the genetic, epigenetic or transcriptional levels. However, an often-disregarded element without which the physiology of stem cells cannot be truly comprehended is the cell metabolism. In this context relatively few works show that in order to support cell function metabolism must be appropriately regulated during different cell processes, such as stem cell self-renewal, proliferation and differentiation. This metabolic adaptation is a meeting point between stem and cancer founding cells, as these present a common metabolic phenotype characteristic of actively proliferating cells. Albeit not widely explored some evidences suggest that metabolism is fundamental for stem cell identity, establishing a bidirectional regulatory dialogue with the genetic processes. T The topic of the present dissertation is therefore the study of metabolic involvement in cell differentiation in two distinct biological models. We hypothesize that metabolic remodeling must accompany the process of cell differentiation. We first focused on the characterization of metabolic remodeling inherent to the differentiation of a rat myoblast cell line profusely used as a model in toxicological studies, the H9c2 cell line. The parental undifferentiated myoblasts, which have a characteristically high proliferation rate, were induced to differentiate towards skeletal muscle-like or cardiomyocytes-like cells, with restricted proliferation. The comparative study of the metabolic profiles from these three distinct populations was based on nuclear magnetic resonance and convincingly confirmed that a marked metabolic shift accompanied the cell specification process. The differentiating cells employed a more energy-efficient metabolism associated with higher mitochondrial oxygen consumption whereas the undifferentiated cells present a higher reliance on glycolysis. Importantly, we have demonstrated that the parental cells have relatively increased anaplerosis in the Krebs cycle and the differentiated cells present a better coupling between glycolysis and the mitochondrial oxidative machinery. In the second part of the thesis, our approach was to evaluate the effects of an active metabolic modulation during neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells (mESC). Here, we demonstrated that the inhibition of the normal mitochondrial electron transport chain activity, particularly due to the application of Antimycin A (AA; a specific inhibitor of mitochondrial complex III), translates into a lower differentiation efficiency. Remarkably, AA treatment was able to maintain pluripotency marker expression on colonies grown for prolonged periods under differentiation-inducing conditions. AA affected distinct population of cells with different maturation states differently. Specifically for mESC, AA did not cause apoptosis but did alter the cell cycle with implications in terms of the proliferation rates. Lastly, we demonstrate that AA treatment stabilized the hypoxia inducible factor HIF-1α in mESC grown in normoxic conditions. HIF-1α is acknowledged to work as an inducer of a metabolic shift favoring increased glycolysis, namely in cancer cells, thus contributing to the Warburg effect, and might be an influential factor for pluripotency maintenance acting downstream of AA in our model. In sum the results presented in this relevant scientific thesis add substance to the notion that a metabolic remodeling is a central element during cell differentiation. The concretization of the stem cell therapeutic potential is intimately dependent on our ability to tame stem cells and efficiently control their properties such as pluripotency, self-renewal and specific differentiation. Our results further contribute to the understanding of metabolism as a credible substrate for modulating stem cell properties, and therefore identify metabolism as an instrumental factor for the attainment of the stem cells promise.

A aplicação de células estaminais tanto num contexto clínico como em modelos toxicológicos é perspectivada como potencial ferramenta para o desenvolvimento de terapias dirigidas a uma grande variedade de estados patológicos. Consequentemente, um significativo corpo de trabalho tem-se avolumado na tentativa de aprofundar o conhecimento que possa sustentar a exploração deste recurso biológico. Este crescente esforço de investigação tem resultado numa melhor compreensão de mecanismos que actuando a um nível preponderantemente genético, epigenético e transcricional sustentam as características únicas das células estaminais. Contudo, a fisiologia destas células não poderá ser totalmente compreendida se não se atender à dinâmica metabólica que a acompanha. Neste âmbito alguns trabalhos demonstram que o metabolismo terá de ser correctamente regulado tanto no processo de autorenovação e proliferação como durante o processo de diferenciação e especialização celular, de modo a adequar-se à função e manutenção da própria célula. Aqui reside um ponto de convergência entre as células estaminais pluripotentes num estado indiferenciado e as células fundadoras de tumores, edificando no seu conjunto um fenótipo metabólico característico de células com grande capacidade proliferativa. Apesar de relativamente pouco explorado, estudos recentes demonstram que o metabolismo concorre para a própria A identidade das células estaminais, estabelecendo uma relação bidireccional de regulação com os processos genéticos. Neste âmbito a presente dissertação trata o envolvimento do metabolismo no processo de diferenciação celular. Numa primeira instância visamos a caracterização da reprogramação metabólica inerente ao processo de diferenciação de um modelo mioblástico de rato, amplamente empregue em estudos toxicológicos, a linha celular H9c2. Estes mioblastos indiferenciados, caracterizados por uma grande taxa proliferativa, foram induzidos a diferenciar em células semelhantes a cardiomiócitos ou células musculares esqueléticas com menor proliferação. O estudo comparativo do perfil metabólico destas três populações baseado em ressonância magnética nuclear demonstrou que o processo de especificação celular é acompanhado por uma alteração coesa do metabolismo visando um aumento de eficiência dos processos energéticos. Assim, verificamos que o estado de indiferenciação celular corresponde a uma situação fisiológica mais dependente da via glicolítica e as populações diferenciadas apresentam uma actividade mitocondrial mais elevada, nomeadamente denotando um maior consumo de oxigénio. Será importante referir ainda que verificamos um maior acoplamento entre a via glicolítica e a actividade mitocondrial nas células diferenciadas e uma maior incidência de actividade anaplerótica no ciclo de Krebs nas células indiferenciadas. Na segunda parte deste trabalho abordamos os efeitos da modelação da actividade da mitocôndria durante a diferenciação neuronal de células estaminais embrionárias (pluripotentes) de ratinho. Demonstramos que a inibição da actividade mitocondrial subsequente à aplicação de um inibidor específico para o complexo III da cadeia respiratória (Antimicina A) traduz-se numa menor eficiência de diferenciação e curiosamente no aumento da percentagem de colónias positivas para marcadores de pluripotência, mesmo em condições indutoras à diferenciação celular. Esta inibição afectou de modo distinto diferentes populações correspondentes a diferentes fases de maturação celular, sendo que ao nível das células estaminais embrionárias não detectamos um incremento de apoptose, mas discernimos alterações no seu ciclo celular com consequente incidência nas dinâmicas de proliferação. Por fim, demonstramos que a aplicação de Antimicina A em células estaminais embrionárias leva a uma estabilização em condições de normoxia do factor induzido por hipoxia HIF-1α, sobejamente reconhecido como indutor de metabolismo glicolítico e que poderá ser um dos factores a contribuir para os efeitos de manutenção de pluripotência nas células estaminais embrionárias. No seu conjunto os resultados desta dissertação vêm comprovar que o metabolismo é um factor preponderante durante o processo de diferenciação celular. A realização do potencial terapêutico das células estaminais esta intimamente dependente da nossa capacidade de controlarmos as suas características e processos celulares como pluripotência, autorenovação e diferenciação específica. Os nossos resultados contribuem ainda para a compreensão do metabolismo como substrato plausível para modelação dessas características, sendo portanto um factor que acreditamos instrumental para a eficaz concretização dos potenciais benefícios das células estaminais.