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Title: Functional interaction between presynaptic nicotinic and adenosine receptors in the control of dopamine release in the striatum
Authors: Garção, Pedro 
Orientador: Agostinho, Paula
Oliveira, Catarina
Keywords: Interação funcional entre receptores no estriado; Localização de receptores nicotínicos no estriado
Issue Date: 10-Dec-2013
Citation: GARÇÃO, Pedro Manuel Venâncio - Functional interaction between presynaptic nicotinic and adenosine receptors in the control of dopamine release in the striatum. Coimbra : [s.n.], 2013. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/23912
Abstract: Os receptores colinérgicos nicotínicos (nAChRs) e os receptores A2A de adenosina (A2ARs) pré-sinápticos são moduladores importantes da libertação de neurotransmissores no estriado. Foi demonstrado que os A2ARs controlam a taxa de desensitização de diferentes nAChRs no sistema nervoso periférico e foi também relatado que, no sistema nervoso central, interagem com outros receptores estriatais, tais como receptores A1 de adenosina, metabotrópicos de glutamato do tipo 5 e canabinóides CB1, sugerindo a possibilidade de uma interação funcional entre nAChRs e A2ARs no estriado, com possiveis implicações relevantes em distúrbios dopaminérgicos como a doença de Parkinson (PD). O estriado é o principal núcleo retransmissor dos gânglios da base, uma rede cerebral essencial em funções sensorimotoras, cognitivas e motivacionais. As projecções glutamatérgicas cortico-estriatais são a principal fonte de entrada excitatória no estriado e são controladas por uma interação coordenada entre diversos neuromoduladores, onde as entradas dopaminérgicas provenientes da substância nigra desempenham um papel fundamental. Os principais moduladores de funções estriatais incluem a adenosina, atuando nos A2ARs metabotrópicos, e a acetilcolina, que atua nos nAChRs ionotrópicos. Estes dois sistemas neuromoduladores têm particular importância já que são alvo de algumas das drogas psicoactivas mais consumidas mundialmente, nomeadamente a nicotina (um agonista dos nAChRs) e a cafeína (um antagonista não-selectivo dos receptores de adenosina); e embora estas duas drogas sejam frequentemente consumidas em simultâneo, pouco se sabe acerca dos seus efeitos combinados. Para além disso, estudos epidemiológicos mostraram que o uso de nicotina e cafeína está relacionado com uma menor incidência da PD. Contudo, a relação entre nAChRs e A2ARs é deficientemente conhecida, e portanto é importante investigar a possivel interação entre estes tipos de receptores em neurónios estriatais. O principal objectivo deste estudo foi investigar a possivel interação funcional entre nAChRs e A2ARs em termos de neurotransmissão no estriado. Para atingir este objectivo foi primeiro detalhada a distribuição sináptica e sub-sináptica de diferentes subunidades de nAChRs, tais como α7, α6, α4 e β2 em terminais nervosos estriatais (sinaptossomas), e foi observado que todas estas subunidades, que formam parte dos principais subtipos de nAChRs, estavam presentes em terminais nervosos. Foram investigados os niveis sub-sinápticos e a distribuição das α7, α6, α4 e β2, na zona activa pré-sináptica, densidade pós-sináptica e em fracções extra-sinápticas (fora da zona activa), dado que os nAChRs podem ter diferentes papéis na neurotransmissão dependendo da sua localização nos diferentes componentes sub-sinápticos. A possível interação funcional pré-sináptica entre diferentes subtipos de nAChRs e A2ARs em terminais dopaminérgicos de rato foi investigada in vitro através da medição da libertação de dopamina de terminais nervosos estriatais e in vivo pela avaliação da sensitização locomotora de ratos em resposta a nicotina, na presença ou ausência de um antagonista dos A2ARs. No estriado de roedores observou-se que a subunidade α7, que faz predominantemente parte do subtipo α7 de nAChRs homomérico sensível à α-bungarotoxina, estava principalmente presente na zona activa pré-sináptica. As subunidades α4 e β2 exibiram uma distribuição semelhante entre si, estando primariamente presentes em zonas pré-sinápticas e extra-sinápticas, o que é esperado dado que estas duas subunidades juntas formam nAChRs heteropentaméricos. Em contraste com as anteriores, a subunidade α6 estava principalmente presente na fracção pós-sináptica, embora estando também presente em fracções pré- e extra-sinápticas. Estes resultados sublinham a possível relevância de nAChRs estriatais em controlar a neurotransmissão. Os estudos in vitro de libertação de dopamina mostraram que a nicotina provocou a libertação de [3H]dopamina de um modo dependente da concentração, de terminais nervosos estriatais de rato. De modo relevante, foi observado que o agonista selectivo dos A2ARs CGS21680, inibiu significativamente, enquanto que ZM241385, um antagonista dos A2ARs, potenciou significativamente a libertação de [3H]dopamina estimulada por nicotina. O antagonista dos A2BRs, MRS1754, não potenciou a libertação. Os ligandos dos receptores de adenosina CGS21680 e cafeína também estimularam a libertação de [3H]dopamina per se. Antagonistas de subtipos de nAChRs que contém a subunidade α6 (α6*) e de subtipos que contém a subunidade β2, mas não do subtipo α7 de nAChRs, inibiram significativamente a libertação de [3H]dopamina. Sob bloqueio dos α6* nAChRs a restante libertação de [3H]dopamina estimulada por nicotina já não foi sujeita a modulação por ligandos dos A2ARs, indicando que a função dos α6β2* nAChRs está acoplada aos A2ARs. A relevância in vivo da cooperação entre os α6β2* nAChRs e os A2ARs foi também avaliada. Em experiências de sensitização locomotora foi observado que a nicotina aumentou significativamente a actividade locomotora de ratos a partir do dia 7 de injecção de nicotina, mas que o aumento já não persistiu depois de 8 dias de abstinência. Ratos injectados com ZM241385 desenvolveram sensitização locomotora à nicotina logo no dia 2 de injecção, que não foi diminuída pelo período de 8 dias livre de fármacos, reforçando os indícios quanto a uma interação funcional entre os α6β2* nAChRs e os A2ARs. No seu conjunto, este trabalho detalha a densidade estriatal sub-sináptica de algumas das principais subunidades de nAChRs e providencia a primeira evidência para uma interação funcional entre receptores nicotínicos e de adenosina em terminais dopaminérgicos estriatais, com prováveis consequências terapêuticas para a doença de Parkinson, dependência nicotínica e outros distúrbios dopaminérgicos.
Presynaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) and adenosine A2A receptors (A2ARs) are key modulators of striatal neurotransmitter release. The A2ARs were shown to control the rate of desensitization of different nAChRs in the peripheral nervous system and have also been reported to interact, in the central nervous system, with other striatal receptors, such as adenosine A1, metabotropic glutamate type 5 and CB1 cannabinoid receptors, suggesting the possibility for a functional interaction between nAChRs and A2ARs in the striatum, with possible relevant implications in dopaminergic disorders like Parkinson´s disease (PD). The striatum is the main relay nucleus of the basal ganglia, a brain network essential in sensorimotor, cognitive and motivational functions. The glutamatergic corticostriatal projections are the leading excitatory inputs to the striatum and are controlled by a coordinated interaction among several neuromodulators, where the dopaminergic inputs from the substantia nigra play a prominent role. The main modulators of striatal functions include adenosine, acting at the metabotropic A2ARs, and acetylcholine, which acts at ionotropic nAChRs. These two neuromodulation systems have particular interest since they are targeted by some of the most widely consumed psychoactive drugs worldwide, namely nicotine (a nAChR agonist) and caffeine (a nonselective adenosine receptor antagonist); and albeit these two drugs are often consumed simultaneously little is known about their combined effects. Moreover, epidemiological studies showed that nicotine and caffeine use is related with a lower incidence of PD. Notwithstanding, the relation between nAChRs and A2ARs is poorly understood, and thus it is important to investigate the possible interaction between these types of receptors in striatal neurons. The main goal of this study was to investigate the possible functional interaction between nAChRs and A2ARs in terms of neurotransmission in the striatum. To achieve this goal it was first detailed the synaptic and subsynaptic distribution of different nAChR subunits, such as α7, α6, α4 and β2 in stratial nerve terminals (synaptosomes), and it was observed that all these subunits, which make part of the main nAChRs subtypes, were present in nerve terminals. The subsynaptic levels and distribution of α7, α6, α4 and β2 were investigated in the presynaptic active zone, postsynaptic density and in extra-synaptic fractions (outside the active zone), since the nAChRs might have different roles in neurotransmission depending on their localization in the different subsynaptic components. The possible presynaptic functional interaction between different nAChR subtypes and A2ARs in rat dopaminergic nerve terminals was investigated by measuring the in vitro dopamine release from striatal nerve terminals and in vivo by assessing the rat locomotor sensitization in response to nicotine, in the presence or absence of an A2AR antagonist. In the rodent striatum we found that the α7 subunit, which predominantly makes part of the homomeric α7 nAChR subtype sensitive to α-bungarotoxin, was mainly present in the presynaptic active zone. The α4 and β2 subunits displayed a similar distribution, being primarily present in presynaptic and in extrasynaptic zones, which was expected since these two subunits together form heteropentameric nAChRs. By contrast to the former, the α6 subunit was mainly present in the postsynaptic fraction, albeit being also present in pre- and extra-synaptic fractions. These results underline the possible relevance of striatal nAChRs in controlling neurotransmission. The in vitro dopamine release studies showed that nicotine elicited the release of [3H]dopamine in a concentration-dependent manner from rat striatal nerve terminals. Notably, it was observed that the selective A2AR agonist CGS21680, significantly inhibited, while ZM241385, an A2AR antagonist, significantly potentiated the nicotine-stimulated [3H]dopamine release. The A2BR antagonist MRS1754 did not potentiate the release. Adenosine receptor ligands CGS21680 and caffeine also stimulated the release of [3H]dopamine per se. Antagonists of α6-containing (α6*) and of β2-containing nAChRs, but not of the α7 nAChR subtype, significantly inhibited release of [3H]dopamine. Under the blockade of the α6* nAChRs the remaining nicotine-stimulated [3H]dopamine release was no longer subject to modulation by A2AR ligands, indicating that the α6β2* nAChRs function is coupled to A2ARs. The in vivo relevance of the interplay between α6β2* nAChRs and A2ARs was also assessed. In locomotor sensitization experiments it was observed that nicotine significantly augmented the locomotor activity of rats from the day 7 of nicotine injection, but it no longer persisted after 8 days of abstinence. ZM241385-injected rats developed locomotor sensitization to nicotine already on day 2 of injection, which was not blunted by the 8 day drug-free period, reinforcing the contention for a functional interaction between the α6β2* nAChRs and the A2ARs. Altogether, this work details the striatal subsynaptic density of some of the main nAChR subunits and provides the first evidence for a functional interaction between nicotinic and adenosine receptors in striatal dopaminergic terminals, with likely therapeutic consequences for Parkinson’s disease, nicotine addiction and other dopaminergic disorders.
Description: Tese de doutoramento do Programa de Doutoramento em Ciências da Saúde, no ramo de Ciências Biomédicas, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/23912
Rights: openAccess
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