O papel dos receptores de adenosina A2A em astrócitos - implicações para a actividade glutamatérgica

Abstract

Nos últimos anos, a visão clássica de astrócitos como simples células de suporte de neurónios tem sido substituída por um novo paradigma em que os astrócitos são considerados elementos activos de processamento cerebral. Tal concepção é baseada na existência de uma comunicação bidirecional entre astrócitos e neurónios ao nível sináptico que foi denominada como "sinapse tripartida". Além da libertação de gliotransmissores, os astrócitos são capazes de modular sincronicamente a actividade sináptica na sinapse tripartida através de um processo dinâmico de transporte e reciclagem de glutamato, o principal neurotransmissor do Sistema Nervoso Central (SNC). No cérebro de mamíferos, a captação do glutamato é sustentada principalmente através do transportador de glutamato-1 (GLT-I) e pelo transportador de glutamato-aspartato (GLAST), ambos transportadores de alta afinidade do glutamato presentes em astrócitos, que desempenham um papel crucial na prevenção da acumulação de glutamato extracelular. A importância desta função é realçada pelo facto da perturbação da expressão ou atividade destes transportadores resultar na ativação excessiva de receptores de glutamato, resultando numa atividade neuronal anormal e numa eventual morte neuronal por excitotoxicicidade. Em conformidade, um grande número de estudos tem demonstrado que a disfunção no transporte do glutamato está associada a diversas doenças neurológicas (por exemplo, doença de Alzheimer; epilepsia) e vários distúrbios neuropsiquiátricos (por exemplo, esquizofrenia; doença bipolar), para além de estar implicado em alterações de plasticidade sináptica em que se estabelecem muitas alterações mnemónicas e cognitivas. Assim, um esforço considerável tem sido despendido para compreender os mecanismos responsáveis pela regulação dos transportadores, particularmente em processos patológicos. Neste contexto, o papel desempenhado pela adenosina, um modulador clássico e ubíquo do SNC que actua principalmente através da activação de receptores inibitórios do subtipo A1 (A1R) ou receptores excitatórios do subtipo A2A (A2AR), foi aqui investigado na regulação da actividade dos transportadores de glutamato. No presente estudo mostrámos que os A2AR controlam/inibem a captação de glutamato através de um mecanismo dual: i) a activação sistemática (24 h) dos A2AR leva a uma activação da via AMPc/ proteína cinase A que conduz a uma redução dos níveis de ARN mensageiro (ARNm) e proteicos de GLT-I e GLAST, provocando assim a uma redução prolongada da captação de glutamato; ii) por outro lado, a ativação aguda (10 min) dos A2AR inibe imediatamente a captação de glutamato, um resultado que se verificou ser dependente de um acoplamento físico entre o A2AR astrocítico com a ATPase Na+/K+ do subtipo α2 (NKA-α2), que está associada ao GLT-I, num processo de regulação rápida do transporte de glutamato. Em resumo, este duplo mecanismo de inibição dos transportadores de glutamato pelos A2AR astrocíticos proporciona um novo mecanismo que permite compreender a capacidade dos A2AR modularem a actividade glutamatérgica rapidamente e prolongadamente, num processo estreitamente relacionado com a etiologia de diversas doenças cerebrais. Posteriormente foram investigadas as implicações na inibição da captação de glutamato pelos A2AR num modelo de doença de Alzheimer (DA), uma doença neurodegenerativa associada a uma deficiente captação de glutamato, a excitotoxicidade e morte celular. O estudo aqui apresentado examinou a capacidade do bloqueio dos A2AR prevenir a diminuição da captação de glutamato em diferentes preparações de astrócitos cerebrais (in vivo e ex vivo) sujeitas ao peptídeo de beta-amilóide (Aβ1-42). Em conformidade, tanto o bloqueio farmacológico, bem como a excisão genética dos A2AR, conseguiram prevenir eficientemente a diminuição da captação de glutamato em astrócitos em cultura tratados com Aβ1-42 e em vesículas da membrana plasmática de astrócitos (gliossomas) proveniente de ratos injectados intracerebroventricularmente (ICV) com Aβ1-42. No seu todo, estes resultados mostram que os A2AR astrocíticos desempenham um papel crucial no desenvolvimento da disfunção na captação de glutamato induzida pelo Aβ e proporcionam uma justificação suplementar para os benefícios terapêuticos promissores do bloqueio selectivo dos A2AR na patogénese da DA. Finalmente examinámos as consequências comportamentais de uma captação hiperactiva de glutamato causada pela eliminação seletiva dos A2AR astrocíticos (em murganhos Gfa2-A2AR-KO). Assim, mostramos que murganhos Gfa2-A2AR-KO apresentam uma variedade de endofenótipos característicos da esquizofrenia, ou seja, uma diminuição no desempenho da memória operacional (WM) e um aumento significativo da resposta psicomotora ao MK-801, um antagonista dos receptores do glutamato do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA), ambos revertidos pela inibição seletiva dos GLT-I. Além disso, estes resultados sugerem também que os A2AR neuronais e astrocíticos podem ter efeitos neuromodulatórios opostos, dado que a supressão da actividade dos A2AR neuronais mostrou ser pro-cognitiva, enquanto a eliminação selectiva dos A2AR em astrócitos potenciou défices na WM. Finalmente demonstrou-se que a disfunção do sistema glutamatérgico observada estava associada a uma alteração de tráfico membranar das subunidades GluR1/GluR2 dos receptores AMPAR induzido pelos receptores NMDAR2B, sugerindo que a supressão genética dos A2AR astrocíticos pode conduzir a extensas e drásticas alterações no sistema glutamatérgico que conferem susceptibilidade a um tipo de características presentes em esquizofrenia. Em resumo, os resultados aqui apresentados indicam que os A2AR astrocíticos, ao regularem a actividade dos transportadores de glutamato e de possivelmente mecanismos glutamatérgicos adicionais, podem ser mediadores importantes da comunicação entre astrócitos e neurónios, em particular nas disfunções glutamatérgicas subjacentes à doença de Alzheimer e esquizofrenia. Uma compreensão mais detalhada da fisiologia dos transportadores de glutamato e do papel regulador fundamental operado pelos A2AR astrocíticos poderá levar ao potencial desenvolvimento de estratégias terapêuticas para modulação da função dos transportadores de glutamato em diversas doenças cerebrais.

In the last years, the classical view of astrocytes as simple supporting cells for neurons has been replaced by a new paradigm in which astrocytes are active processing elements of the brain. Such novel conception is based on the existence of a bidirectional communication between astrocytes and neurons at the synaptic level in what was termed the “tripartite synapse”. In addition to the release of gliotransmitters, astrocytes are able to synchronously modulate synaptic activity within the tripartite synapse by a dynamic process of glutamate transporting and recycling, the most important neurotransmitter of the Central Nervous System (CNS). In mammals, basal glutamate uptake in the brain is maintained essentially by glutamate transporter-1 (GLT-I) and glutamate-aspartate transporter (GLAST), both astrocyte Na+-dependent high-affinity glutamate transporter types, which play a crucial role in preventing the accumulation of extracellular glutamate. Disrupting the expression or activity of these transporters results in excessive activation of glutamate receptors, abnormal neuronal activity, and eventual excitotoxic neuronal death. In accordance, a great body of work has shown that glutamate transport dysfunction is associated with many neurological diseases (e.g. Alzheimer’s disease; epilepsy, etc) and neuropsychiatric disorders (e.g. schizophrenia; bipolar disease, etc), in addition to being implicated in synaptic plasticity alterations which underlie changes in memory and cognition. Therefore, considerable effort is being expended to understand the mechanisms responsible for transporter regulation and dysfunction in disease. In this context, the role of adenosine, a classical and ubiquitous modulator of the CNS acting mainly via activation of high-affinity inhibitory A1 receptors (A1R) or excitatory A2A receptors (A2AR), was here investigated as a promising candidate regulating glutamate transporter activity. We now report that A2AR control/inhibit the glutamate uptake by a dual mechanism: i) the prolonged (24h) activation of A2AR led to a cAMP/protein kinase A-dependent reduction of GLT-I and GLAST mRNA and protein levels which, in turn, elicits a sustained decrease in glutamate uptake; ii) On the other hand, the acute (10min) activation of A2AR immediately inhibited glutamate uptake, an effect that was found to be dependent on a physical coupling between astrocyte A2AR with Na+/K+-ATPase α2 subtype (NKA-α2), linked to GLT-I in order to rapidly regulate astrocytic glutamate transport. In resume, this dual mechanism of inhibition of glutamate transporters by astrocytic A2AR provides a novel candidate mechanism to understand the ability of A2AR to both rapidly and prolongabily modulate glutamatergic activity, a process intricately associated with the etiology of several brain diseases. Subsequently, we investigated the implications of A2AR inhibiton of glutamate uptake in an animal model of Alzheimer’s disease, a neurodegenerative condition associated with the contribution of a deficient glutamate uptake and ensuing excitotoxicity and cell death. The present study demonstrated the ability of A2AR blockade to prevent the amyloid-beta (Aβ1-42)-induced decrease in glutamate uptake in different (in vivo and ex vivo) brain astrocyte preparations. In accordance, both the pharmacological blockade as well as the genetic excision of A2AR efficiently prevented the decline in glutamate uptake in cultured astrocytes treated with Aβ1-42 and in glial plasmalemmal vesicles (gliosomes) from intracerebroventricularly (ICV) injected Aβ1-42- rats. Together, these results show that astrocyte A2AR play a crucial role in the development of Aβ-induced glutamate uptake dysfunction and provide an additional justification for the promising therapeutic benefits of selective blockade of A2AR in early Alzheimer’s disease pathogenesis. Finally we examined the behavioral consequences of an exacerbated glutamate uptake caused by selective deletion of A2AR in astrocytes (in Gfa2-A2AR KO mice). We here show that Gfa2-A2AR-KO mice exhibit an array of endophenotypes characteristic of schizophrenia, namely a decrease in working memory (WM) performance and an enhanced psychomotor response to MK-801, which were reverted by GLT-I selective inhibition. In addition, the present results also suggest that neuronal and astrocytic A2AR may have opposite neuromodulation effects, since the suppression of neuronal A2AR activity was shown to be pro-cognitive while the selective deletion of astrocytic A2AR potentiated working memory deficits. Finally, we demonstrated that the glutamatergic dysfunction observed was associated with an alteration of NMDAR2B-mediated AMPAR GluR1/GluR2 subunit membrane trafficking, suggesting that genetic deletion of astrocytic A2AR may lead to drastic and extensive modifications in the glutamatergic system that confer susceptibility to a schizophrenia-type of traits and reveal a novel mechanistic view of the fundamental role of the neuron-astrocytic communication in cognitive processes affected. In resume, the results presented here indicate that astrocyte A2AR, by controlling GLT-I activity and possibly additional glutamatergic mechanisms, may be critical mediators of the astrocyte-neuron communication and glutamatergic dysfunction underlying Alzheimer’s disease and schizophrenia. The complete understanding of glutamate transporter physiology and the crucial regulatory role operated by A2AR may lead to the future development of strategies for modulating glutamate transporter function in the treatment of different brain disorders.