Resveratrol-induced activation of the Sirt1/AMPK axis in human CD4 T cells triggers replicative stress and an ATR-dependent cell cycle arrest

Abstract

A activação de linfócitos T, desencadeada por acoplamento do receptor de células T e por várias citocinas, pode apenas ocorrer após a célula gerar energia suficiente. A resposta às crescentes necessidades biossintéticas de uma célula T activada pode ser alcançada pelo aumento da disponibilidade de nutrientes e pela adopção de um metabolismo anabólico, permitindo optimizar a produção de ATP. Em muitos tipos de células diferentes, a função mitocondrial é melhorada pelas proteínas reguladoras de informação silenciosa (Sir), as quais se tratam de deacetilases de histonas dependentes de NAD+ e sensíveis a potencial redox. No entanto, desconhece-se o papel destas proteínas na regulação do metabolismo dos linfócitos T. Resveratrol é um fenol natural com propriedades anti-envelhecimento e anti-inflamatórias, efeitos atribuídos à capacidade deste polifenol em modular o metabolismo celular por indução da actividade da deacetilase Sirtuína 1 (Sirt1). O estudo aqui apresentado mostra que a expressão da proteína Sirt1 aumenta de forma significativa em linfócitos T CD4+ humanos após estimulação do receptor de células T (TCR) e que tratamento com resveratrol promove um acréscimo na actividade desta deacetilase. Esta amplificação da expressão de Sirt1 encontra-se também associada a um aumento na fosforilação dos resíduos de serina na sequência de consenso do sinal de localização nuclear (NLS), algo consistente com as minhas observações de que após activação das células T a expressão de Sirt1 é predominantemente nuclear. Curiosamente, apesar do aumento verificado na expressão de Sirt1, a activação dos linfócitos T encontra-se também associada a um incremento na acetilação dos factores de transcrição p53 e FoxO1, duas proteínas amplamente descritas na literatura como alvos da actividade de deacetilase de Sirt1. Ainda assim, pude verificar que tratamento com resveratrol resultava numa diminuição considerável dos níveis de acetilação de p53 e de FoxO1. De destacar, que o tratamento de linfócitos T CD4 com uma dose alta de resveratrol bloqueia a sinalização proximal ao TCR, resultando numa interrupção do ciclo celular na fase G0. Em contraste, linfócitos T tratados com uma dose baixa de resveratrol não só exibem um estado de activação normal aquando da iniciação do sinal TCR, como são capazes de amplificar as ciclinas e as quinases dependentes de ciclinas (Cdks) necessárias à normal progressão do ciclo celular. Além disso, linfócitos T activos tratados com uma baixa dose de resveratrol exibem elevada actividade metabólica, conforme demonstrado pela maior expressão do transportador de glucose Glut1, respectiva captação de glucose e da função mitocondrial. Além disso, pude ainda verificar que em comparação a linfócitos T activos controlo, os linfócitos T tratados com dose baixa de resveratrol exibem níveis de ATP intracelular mais elevados e um aumento da respiração mitocondrial. De salientar, porém, que apesar de exibirem uma capacidade metabólica notável, tratamento de linfócitos CD4 com uma dose baixa de resveratrol resulta numa paragem do ciclo celular na transição entre as fases G2/M, consequência da ocurrência de um stress genotóxico associado ao aumento da fosforilação da histona H2AX, um marcador de quebra da cadeia dupla de ADN e da helicase de manutenção de minicromossomas Mcm2. A fosforilação tanto da histona H2AX como da helicase Mcm2 encontram-se associadas ao fenómeno de stress replicativo e no decurso do meu estudo foi-me possível verificar que o bloqueio do ciclo celular na transição G2/M se deve à activação do guardião do genoma e regulador do ciclo celular, p53. Adicionalmente, pude também verificar que esta activação de p53 era mediada simultaneamente pela quinase ATR, um dos principais mediadores da reparação de ADN em resposta a um stress replicativo, e pela quinase AMPK, uma enzima conhecida por se associar a Sirt1 na regulação do equilíbrio energético das células. Em conclusão, se por um lado o tratamento de linfócitos T com resveratrol resulta num incremento metabólico e energético graças a um aumento na activade das enzimas Sirt1 e AMPK, por outro, acaba por afectar a integridade genómica levando à activação de p53 e, consequentemente, a um bloqueio na progressão do ciclo celular.

T lymphocyte activation, triggered by T cell receptor engagement and by various chemokines, can only occur when the cell has generated sufficient energy resources. The increased biosynthetic demands of an activated T cell can be met by increasing nutrient availability and adopting an anabolic metabolism, allowing an enhanced ATP generation. In many different cell types, mitochondrial function is enhanced by the Silent information regulator (Sir) proteins, NAD+-dependent redox-sensing histone deacetylases. However, the role of these proteins in regulating T lymphocyte metabolism is not known. Resveratrol is a natural polyphenol that possesses anti-aging and anti-inflammatory properties, being its effects attributed to its capacity to modulate cellular metabolism via induction of the Sirtuin1 (Sirt1) histone deacetylase. Here, I show that Sirt1 is highly upregulated following TCR stimulation of primary human CD4 T lymphocytes with resveratrol further augmenting Sirt1 expression and deacetylase activity. Sirt1 upregulation is also associated with phosphorylation of serine residues in the Nuclear Localization Signal (NLS) consensus, consistent with my observations that Sirt1 is predominantly nuclear following T cell activation. Despite the increase in Sirt1 expression, I find that T cell activation leads to an increased acetylation of p53 and FoxO1, two known Sirt1 targets. Not surprisingly, the TCR-induced acetylation of p53 and FoxO1 was significantly decreased following activation of the Sirt1 deacetylase with resveratrol. Importantly, high dose resveratrol blocked proximal TCR signaling and progression from the G0 phase of the cell cycle. In contrast, CD4 T lymphocytes treated with low dose resveratrol were strongly activated and upregulated all cyclins and Cyclin-dependent kinases (Cdks) required for cell division. Furthermore, these cells exhibited high metabolic activity as monitored by upregulation of the Glut1 glucose transporter, increased glucose uptake and enhanced mitochondrial function. De facto, when compared to control cells, activated T lymphocytes treated with low dose resveratrol show boosted mitochondrial respiration and higher intracellular ATP levels. Nevertheless, low dose resveratrol induced a G2/M genotoxic arrest, with augmented phosphorylation of the histone H2AX double-stranded DNA break marker and the minichromosome maintenance helicase Mcm2. Phosphorylation of both H2AX and Mcm2 is associated with the onset of replicative stress, and I was able to verify that the cell cycle exit observed in lymphocytes treated with low dose resveratrol was associated with the activation of p53. Furthermore, I found that this activation of p53 was mediated both by the serine/threonine-protein kinase ATR, which is involved in sensing DNA damage and activating the DNA damage response, and the AMP-activated protein kinase (AMPK), a fuel sensor known to interact with Sirt1 and share many of its targets. Thus, while resveratrol increased Sirt1 and AMPK activity, producing a positive energy balance in CD4 T cells, its negative regulation of DNA integrity resulted in the induction of a p53-dependent cell cycle checkpoint