Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/23741
Title: Development of novel therapeutic approaches for wound healing in diabetes
Authors: Moura, Liane 
Orientador: Carvalho, Eugénia
Sousa, Hermínio C. de
Keywords: Wound healing; Diabetes
Issue Date: 5-Nov-2013
Citation: MOURA, Liane Isabel Ferreira - Development of novel therapeutic approaches for wound healing in diabetes. Coimbra : [s.n.], 2013. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/23741
Abstract: Diabetes mellitus is one of the chronic diseases that affect more people worldwide. Patients with diabetes are susceptible to develop chronic, non-healing diabetic foot ulcers (DFU) which cause pain, suffering, poor quality of life and, in extreme cases, lower extremities amputations. This fact together with the high prevalence of DFU among the diabetic population (around 15%) increases the necessity to find new and more efficient approaches for DFU treatment. Some neuropeptides, such as Substance P (SP) and Neuropeptide Y (NPY), are known to have an important role in the inflammatory, proliferative and reparative processes after tissue injury. However, little is known about the effect of other neuropeptide, neurotensin (NT), in these processes. Recent studies indicated that some of the above referred neuropeptides may act as inflammatory modulators and that may improve the diabetic wound healing process through topical application into wounds. However, one of the major problems associated to the topical administration of peptides, in general and neuropeptides in particular, are their short half-lives and the corresponding loss of bioactivity in the peptidase-rich wound environment. An alternative strategy to overcome these issues can be the use of biocompatible wound dressings for the sustained delivery of these neuropeptides. Some biopolymers such as collagen and chitosan derivatives may be employed for these purposes mostly due to their well known favorable properties and biological behavior, namely their ability to load/release bioactive substances, and their biocompatibility, biodegradability and non-toxicity. In this thesis, the in vitro effects of NT in the migration, proliferation and regulation of cytokine expression of skin cells, namely in macrophages and keratinocytes, under hyperglycemic and/or inflammatory conditions were studied. Moreover, the analysis of the expression of NT and of its receptors was also performed under the above described conditions. In addition, the development and characterization of three chitosan derivatives (N-carboxymethyl chitosan (CMC), 5-methyl pyrrolidinone chitosan (MPC) and N-succinyl chitosan (SC)) and of type I mice collagen-based dressings as supports for the topical delivery of NT into diabetic wounds were performed. The evaluation of the progression of wound healing and of modulation of inflammatory, angiogenic and re-epithelializating factors were performed (in vivo) using MPC and collagen-based dressings (with or without the release of NT) in a full-thickness wound healing model in diabetic mice. From in vitro results, it was concluded that NT impairs macrophage migration under hyperglycemic conditions as well as it decreases their pro-inflammatory cytokines (IL-1β and IL- 12) expression under hyperglycemic and inflammatory conditions. In addition, it was also found that hyperglycemia modulates NT and NT receptor expression in both tested conditions. On the other hand and for human keratinocytes, the presence of NT strongly stimulated NT and NTR2 expression. However, results also showed that NT did not affect cell proliferation and migration, as well as the expression of some inflammatory cytokines (IL-1β and IL-8) and growth factors (EGF, VEGF and PDGF) under hyperglycemic conditions. These results thus suggest that NT did not exert a direct effect on keratinocytes function, but it seems to present a paracrine effect on other skin cells such as fibroblasts, macrophages and dendritic cells. From in vivo tests, it was found that NT alone induced faster healing in either control (22%) or diabetic (29%) wounds at day 3 (if compared to non-treated wounds). MPC alone and NT-loaded MPC dressings presented different wound healing profiles either in control or in diabetic mice, at day 1 post-wounding, leading to significant reductions in wound sizes (48% and 43%, respectively, in control, and 35% and 50%, respectively in diabetic animals). RT-PCR analysis showed that NTloaded MPC dressings reduced inflammatory cytokines expression (TNF-α) and decreased the inflammatory infiltrate at day 3. At day 10, the MMP-9 expression was also reduced in diabetic mouse skin, and led to increased fibroblast migration and to a higher collagen (COL1A1, COL1A2 and COL3A1) expression and deposition in wound sites. Results obtained when using NT-loaded collagen dressings showed that, in diabetic mice, a faster healing was achieved (17% wound area reduction). In addition, this strategy significantly reduced the inflammatory cytokine expression (TNF-α and IL-1β) as well as the inflammatory infiltrate, at day 3 post-wounding. After complete healing (fd), the MMP-9 expression was also reduced in diabetic mouse skin. Once again, this probably led to fibroblast migration and to higher collagen (COL1A2 and COL3A1) expression and deposition. Finally and in conclusion, all the obtained results (in vitro and in vivo) indicate that NT may enhance diabetic wound healing and its activity can be further improved when it is loaded into MPC or collagen based dressings. The results presented in this thesis show that NT is a promising neuropeptide that can be used for the treatment of diabetic wounds, either alone or, preferably, combined with biocompatible and biodegradable wound dressings. Therefore, these results can/should be further developed in order to obtain new and more efficient bioactive wound dressings for treatment of DFU and even of other types of wounds.
Diabetes mellitus é uma das doenças crónicas que afecta mais pessoas em todo o mundo. Os pacientes com diabetes são susceptíveis ao desenvolvimento de úlceras crónicas e não cicatrizantes do pé diabético (DFU), que causam dor, sofrimento fraca qualidade de vida e, em casos extremos, amputações das extremidades inferiores. Estes factos juntamente com a alta prevalência das DFU entre a população diabética (cerca de 15%) aumenta a necessidade de encontrar novas e mais eficientes abordagens para o tratamento das DFU. Alguns neuropeptídeos, nomeadamente a Substância P (SP) e o Neuropeptídeo Y (NPY), são conhecidos por desempenharem um papel importante no processo inflamatório, proliferativo e reparativo após a lesão dos tecidos. Contudo, pouco é conhecido acerca do efeito do neuropeptídeo, neurotensina (NT) nestes processos. Estudos recentes indicam que alguns dos neuropeptídeos referidos atrás podem actuar como modeladores inflamatórios e que podem melhorar o processo de cicatrização nos diabéticos através da aplicação tópica destes nas feridas. Contudo, um dos maiores problemas associados à administração tópica de peptídeos, em geral e neuropeptídeos em particular, são os seus tempos de meia vida e correspondente perda de bioactividade em feridas ricas em peptidases. Uma estratégia alternativa para superar estas questões passa pelo uso de dressings (pensos curativos ou apósitos) biocompatíveis para a libertação continuada destes neuropeptídeos. Alguns biopolímeros como o colagénio e os derivados do quitosano podem ser utilizados neste âmbito devido às suas propriedades favoráveis conhecidas e ao seu comportamento biológico, nomeadamente à sua capacidade de carregar/libertar substâncias bioactivas, e à sua biocompatibilidade, biodegradabilidade e não toxicidade. Nesta tese, os efeitos in vitro da NT na migração, proliferação e regulação da expressão das citocinas nas células da pele, nomeadamente em macrófagos e em queratinócitos, em condições hiperglicémicas e/ou inflamatórias foram estudados. Além disso, a análise da expressão de NT e seus receptores foi também realizada nas condições acima descritas. Também se desenvolveram e caracterizaram dressings baseados em três derivados do quitosano (N-carboximetil quitosano (CMC), 5-metilpirrolidinona quitosano (MPC) e N-succinil quitosano (SC)) e baseados em colagénio tipo 1 de ratinho como suporte para a libertação tópica de NT em feridas diabéticas. A avaliação da progressão da cicatrização das feridas e a modulação de factores inflamatórios, angiogénicos e de re-epitelialização foi realizada in vivo usando dressings baseados em MPC e colagénio (com ou sem a libertação de NT) num modelo de cicatrização de espessura total em ratinhos diabéticos. Dos resultados in vitro, podemos concluir que a NT prejudica a migração de macrófagos em condições inflamatórias assim como diminui a expressão de citocinas pro-inflamatórias (IL-1β e IL-12) em condições hiperglicémicas e inflamatórias. Além disso, verificou-se que a hiperglicemia modula a expressão da NT e seus receptores em ambas as condições testadas. Por outro lado e nos queratinócitos humanos, a presença de NT estimulou fortemente a expressão de NT e NTR2. Contudo, os resultados também mostraram que a NT não afectou a proliferação e migração celular assim como a expressão de alguns factores inflamatórios (IL-1β e IL-8) e factores de crescimento (EGF, VEGF e PDGF) em condições hiperglicémicas. Estes resultados sugerem que a NT não exerce um efeito directo na função dos queratinócitos, mas parece apresentar um efeito parácrino em outras células da pele como os fibroblastos, os macrófagos e as células dendríticas. Dos resultados in vivo, verificou-se que a aplicação de NT sozinha induziu uma cicatrização mais rápida das feridas tanto nos controlos (22%) assim como nos diabéticos (29%) ao dia 3 após ferimento (quando comparado com feridas não tratadas). Os dressings de MPC sozinho ou MPC carregado com NT apresentaram diferentes perfis de cicatrização das feridas tanto nos controlos como nos ratinhos diabéticos, no dia 1 após o ferimento, conduzindo a reduções significativas do tamanho das feridas (48% e 43%, respectivamente nos controlos, e 35% e 50%, respectivamente nos animais diabéticos). A análise por RT-PCR mostrou que os dressings de MPC carregados com NT reduziram a expressão de citocinas inflamatórias (TNF-α) assim como reduziram o infiltrado inflamatório ao dia 3. No dia 10, a expressão de MMP-9 foi também reduzida na pele dos ratinhos diabéticos, o que levou ao aumento da migração dos fibroblastos e à maior expressão e deposição de colagénio (COL1A1, COL1A2 e COL3A1) nas feridas. Os resultados obtidos quando se usaram dressings de colagénio carregados com NT mostraram que, foi conseguida uma cicatrização mais rápida em ratinhos diabéticos (redução de 17% da área da ferida). Além disso, esta estratégia reduziu significativamente a expressão de citocinas inflamatórias (TNF-α and IL-1β) assim como o infiltrado inflamatório, no dia 3 após o ferimento. Após completa cicatrização (fd), a expressão de MMP-9 encontra-se também reduzida na pele dos ratinhos diabéticos com este tratamento. Uma vez mais, este resultado conduziu à migração dos fibroblastos e ao aumento da expressão e deposição de colagénio (COL1A2 e COL3A1). Finalmente e em conclusão, todos os resultados obtidos (in vitro e in vivo) indicam que a NT pode estimular a cicatrização de feridas diabéticas e a sua actividade pode ser melhorada quando é carregada em dressings à base de MPC ou colagénio. Os resultados apresentados nesta tese mostram que a NT é um neuropeptídeo promissor que pode ser usado no tratamento de feridas diabéticas, quer sozinha ou preferivelmente combinada com dressings biocompativeis e biodegradáveis. Portanto, estes resultados podem/devem ser posteriormente desenvolvidos de modo a obter novos e mais eficientes dressings para o tratamento da DFU e até mesmo para outros tipos de feridas.
Description: Tese de doutoramento em Engenharia Química, na especialidade de Biotecnologia, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/23741
Rights: openAccess
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