Acitretina e isotretinoína: estudos mitocondriais, celulares e de citogenotoxicidade. Ação combinada com antiestrogénios, NBUVB ou PUVA

Abstract

A acitretina e a isotretinoína são retinoides frequentemente utilizados no tratamento de algumas doenças inflamatórias da pele, constituindo também uma estratégia promissora na quimioprevenção do cancro. A associação dos retinoides com os antiestrogénios tem vindo a ser estudada, de forma a minimizar os efeitos adversos e a aumentar a eficácia terapêutica. No entanto, os mecanismos de ação farmacológica e toxicológica destes retinoides individualmente ou em associação com os antiestrogénios permanecem por esclarecer, e pouco é conhecido acerca dos seus efeitos secundários em associações terapêuticas com a fototerapia com radiação UVB de banda estreita (NBUVB) ou com a fototerapia com radiação UVA e psoraleno (PUVA), usadas no tratamento de doenças inflamatórias da pele. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos da acitretina e da isotretinoína individualmente ou em associação com os antiestrogénios tamoxifeno (TAM) e 4-hidroxitamoxifeno (OHTAM) em mitocôndrias de fígado de rato e em linhas celulares de melanoma e de cancro da mama. Foram também avaliados os efeitos citogenotóxicos in vitro da acitretina e da isotretinoína, bem como os efeitos da acitretina em associação com o TAM e com o OHTAM em culturas de sangue de voluntários saudáveis. Adicionalmente, foram estudados os efeitos citogenotóxicos in vivo e as alterações hematológicas e bioquímicas induzidas pela acitretina e isotretinoína em monoterapia ou em associação com a NBUVB ou com a PUVA, em doentes com psoríase vulgaris e com acne vulgaris. Os estudos em mitocôndrias demonstraram que a acitretina e a isotretinoína (5 nmoles/mg proteína) diminuíram a produção de energia e aumentaram a sensibilidade das mitocôndrias hepáticas para a permeabilidade transitória mitocondrial (MPT) induzida por Ca2+, como consequência da interação destes retinoides com o transportador de nucleótidos de adenina (ANT). A diminuição do conteúdo de ANT sugere que os mecanismos de apoptose e de toxicidade hepática induzidos pela acitretina e pela isotretinoína ocorrem, possivelmente, através de disfunções mitocondriais, devido a interações com o ANT. Além disso, observámos que o TAM e o OHTAM (10 nmoles/mg proteína ou 5 μM) inibiram a MPT induzida pela acitretina e pela isotretinoína, o que contribui para diminuir a toxicidade induzida por estes retinoides, provavelmente por impedirem as mudanças conformacionais do ANT envolvidas na indução da MPT. Estudos em linhas celulares de melanoma e de cancro da mama demonstraram que a acitretina (5 μM) e a isotretinoína (0,5 μM) em associação com o TAM ou com o OHTAM (5 e 7,5 μM) aumentaram sinergisticamente os efeitos antiproliferativos de cada composto individualmente. O efeito antiproliferativo destas associações, observado na linha celular de melanoma, não se deve a mecanismos de morte celular sendo uma consequência da paragem do ciclo celular na fase G0/G1. A associação da acitretina ou da isotretinoína com o OHTAM apresentou um maior efeito antiproliferativo do que a associação do TAM devido, provavelmente, à maior afinidade para os recetores de estrogénio (ERs). Os estudos de genotoxicidade in vitro demonstraram que a acitretina e a isotretinoína (1,2 – 20 μM), bem como a acitretina em associação com os antiestrogénios não apresentaram efeitos genotóxicos. Relativamente, aos estudos de genotoxicidade in vivo, verificou-se que as terapêuticas com acitretina (monoterapia ou em associação com a NBUVB) ou com isotretinoína (monoterapia) não induziram efeitos genotóxicos. No entanto, são necessários mais estudos para esclarecer o potencial genotóxico da terapêutica com acitretina + PUVA ou com isotretinoína + NBUVB. Os estudos in vivo incluíram também a avaliação das alterações bioquímicas e hematológicas induzidas por estas terapêuticas em doentes com psoríase vulgaris e acne vulgaris. Verificámos que a acitretina (em monoterapia ou associada com PUVA) ou a isotretinoína (em monoterapia ou associada com NBUVB), após 12 semanas de tratamento não induziram toxicidade renal. No entanto, os doentes tratados com acitretina + NBUVB, após 12 semanas, apresentaram um aumento nos níveis de creatinina, sugerindo uma possível toxicidade renal. A terapêutica com acitretina (em monoterapia ou associada com NBUVB ou com PUVA), ou com isotretinoína (em monoterapia ou em associação com NBUVB), após 12 semanas, não induziram alterações no metabolismo da glucose. Contudo, verificou-se uma diminuição da sensibilidade à insulina, após um tratamento prolongado com acitretina (24 e 36 semanas) ou com isotretinoína (24 semanas). Verificámos que a terapêutica com acitretina (em monoterapia ou associada com NBUVB ou PUVA) ou com isotretinoína (em monoterapia ou em associação com NBUVB), após 12 semanas, não induziram toxicidade hepática. No entanto, uma terapêutica prolongada com acitretina (24 ou 36 semanas) ou com isotretinoína (24 semanas), induziu toxicidade hepática e disfunção muscular. Em conclusão, este estudo sugere que a acitretina ou a isotretinoína associadas com os antiestrogénios apresentam uma potencial aplicação na quimioprevenção do melanoma e do cancro da mama, sendo a associação com o OHTAM a que tem uma maior eficácia no tratamento do melanoma. A associação com os antiestrogénios pode fornecer uma poderosa estratégia para ultrapassar a toxicidade destes retinoides, sem efeitos genotóxicos. Por outro lado, os estudos em doentes sugerem que a acitretina e a isotretinoína individualmente ou em associação com NBUVB ou PUVA não induzem alterações significativas nos biomarcadores clínicos, exceto para a função hepática, muscular e para o metabolismo da glucose.

Acitretin and isotretinoin are retinoids frequently used to treat some inflammatory skin disorders, and are also a promising strategy for cancer chemoprevention. The combination of retinoids with antiestrogens has been studied to minimize side effects and to achieve a higher efficacy. However, the mechanisms underlying the pharmacological and toxicological effects of these retinoids individually or in combination with antiestrogens remain unclear, and little is known about their adverse effects in combined therapies with narrow-band UVB (NBUVB) or with psoralen associated to UVA irradiation (PUVA), used to treat inflammatory skin disorders. The aim of this work was to study the effects of acitretin and isotretinoin individually or in combination with the antiestrogens tamoxifen (TAM) and 4-hydroxytamoxifen (OHTAM), in rat liver mitochondria and in melanoma and breast cancer cell lines. We also evaluated the in vitro cytogenotoxic effects of acitretin and isotretinoína, as well as the effects of acitretin in combination with TAM and OHTAM, using blood cultures from healthy volunteers. Moreover, we studied the in vivo cytogenotoxic effects and the hematological and biochemical changes induced by acitretin and isotretinoin in monotherapy or combined with NBUVB or with PUVA, in patients with psoriasis vulgaris and acne vulgaris. The mitochondrial studies showed that acitretin and isotretinoin (5 nmol/mg protein) decreased the energy production and increased the sensitivity to Ca2+-induced mitochondrial permeability transition (MPT), as a consequence of the interaction of those retinoids with the adenine nucleotide translocase (ANT). The reduced ANT content suggests that the mechanisms of apoptosis and hepatotoxicity induced by acitretin and isotretinoin occur, possibly, through mitochondrial dysfunction, due to interactions with ANT. Moreover, we observed that TAM and OHTAM (10 nmol/mg protein or 5 µM) inhibited the MPT induced by acitretin and isotretinoin, contributing to decrease the toxicity induced by these retinoids, probably by preventing the ANT conformational changes involved in MPT induction. The studies in melanoma and breast cancer cell lines showed that acitretin (5 μM) and isotretinoin (0.5 μM) in combination with TAM or with OHTAM (5 and 7.5 μM) increased synergistically the anti-proliferative effects of each compound individually. The anti-proliferative effect of these combinations, observed in melanoma cell lines, is not due to cell death mechanisms and seems to be a consequence of cell cycle arrest in G0/G1 phase. Acitretin and isotretinoin combined with OHTAM presented a higher anti-proliferative effect than the combination with TAM, probably due to its higher affinity to estrogen receptors (ERs). The in vitro genotoxic studies showed that acitretin and isotretinoin (1.2 to 20 µM), as well as acitretin in combination with antiestrogens did not present genotoxic effects. Concerning the in vivo genotoxic studies, we found that the therapies with acitretin (monotherapy or combined with NBUVB) or with isotretinoin (monotherapy) did not induce genotoxic effects. However, further studies are needed to clarify the genotoxic potential of therapy with acitretin + PUVA or with isotretinoin + NBUVB. The in vivo studies included also the evaluatin of biochemical and hematological changes induced by those therapies in patients with psoriasis vulgaris and acne vulgaris. We found that acitretin (monotherapy or combined with PUVA) or isotretinoin (monotherapy or combined with NBUVB), after 12 weeks of therapy did not induce renal toxicity. However, patients treated with acitretin + NBUVB, after 12 weeks, showed an increase in serum creatinine levels, suggesting a possible renal toxicity. The therapy with acitretin (monotherapy or combined with NBUVB or with PUVA) or with isotretinoin (monotherapy or combined with NBUVB), after 12 weeks, did not alter the glucose metabolism. However, we found a decrease of insulin sensitivity after a prolonged therapy with acitretin (24 to 36 weeks) or with isotretinoin (24 weeks). We showed that the therapy with acitretin (monotherapy or combined with NBUVB or PUVA) or with isotretinoin (monotherapy or combined with NBUVB), after 12 weeks, did not induce hepatic toxicity. However, a longer therapy with acitretin (24 or 36 weeks) or with isotretinoin (24 weeks), induced hepatic toxicity and muscle dysfunction. In conclusion, this study suggests that acitretin and isotretinoin combined with antiestrogens have a potential application in the chemoprevention of melanoma and breast cancer; the combination with OHTAM seems to have a higher efficacy in the treatment of melanoma. The combination with antiestrogens can provide a powerful strategy to overcome the toxicity of these retinoids, without genotoxic effects. On the other hand, the studies in patients suggest that acitretin and isotretinoin individually or in combination with NBUVB or PUVA did not induce significant changes in clinical biomarkers, except for liver and muscle functions, and for glucose metabolism.