Terapia génica : avaliação do potencial terapêutico em células de carcinoma hepatocelular em cultura

Abstract

O carcinoma hepatocelular (CHC) é uma doença com mau prognóstico cuja incidência tem aumentado dramaticamente nas últimas décadas. Muitos estudos têm vindo a ser realizados e variados protocolos investigados para o seu tratamento. Apesar disso, a taxa de mortalidade dos doentes com CHC avançado ainda é muito elevada, havendo assim a necessidade de desenvolvimento de novos fármacos, e de novas opções de tratamento, que poderão ser utilizados como agentes únicos ou em combinação. Esta falta de opções terapêuticas seguras e eficientes contra muitos tipos de cancro tem vindo a incentivar o desenvolvimento de novas aplicações para a terapia génica. A terapia génica suicida envolve a entrega de um gene suicida às células-alvo, tornando-as sensíveis a determinado pró-fármaco sendo os sistemas mais utilizados a timidina cinase do Vírus Herpes Simplex (HSV-TK)/ ganciclovir (GCV) e a citosina desaminase bacteriana (CD)/ 5-fluorocitosina (5-FC). A entrega do material genético pode ser feita por vectores virais ou não virais. Devido aos problemas que têm surgido com a utilização de vectores virais, principalmente relacionados com questões de segurança, os lipossomas catiónicos surgiram como sistemas promissores, devido à sua baixa toxicidade e imunogenicidade, à falta de patogenicidade e versatilidade. O objectivo do presente estudo consiste na avaliação do potencial terapêutico in vitro, em linhas celulares de carcinoma hepatocelular (HUH-7 e Hep-G2), das estratégias de terapia génica suicida (HSV-TK / GCV ou CD / 5-FC), em monoterapia ou em terapia combinada com agentes de quimioterapia convencional (doxorrubicina) e novos fármacos dirigidos a alvos moleculares (inibidor proteasoma MG-262), utilizando para a transfecção lipossomas associados a transferrina. A viabilidade foi avaliada pela técnica do Alarmar Blue e os mecanismos de morte verificados por citometria de fluxo com AV/IP, morfologia em esfregaços corados por May-Grünwald-Giemsa e análise do ciclo celular. Os resultados obtidos indicam que a aplicação da terapia génica suicida utilizando os sistemas HSV-TK/GCV ou CD/5-FC, tem um efeito antiproliferativo e citotóxico dependente da dose de pro-fármaco utilizada e do tempo de incubação. A combinação destas abordagens terapêuticas com doses inferiores ao IC50 de MG-262 ou doxorrubicina apresenta aumento do efeito antiproliferativo e citotóxico, indicando que a aplicação combinada de doses mais baixas de outros fármacos poderá levar a uma potenciação dos resultados com níveis de toxicidade e efeitos secundários reduzidos. Este efeito antiproliferativo foi verificado através das alterações observadas no ciclo celular das células (acumulação na fase G2 / M). Por citometria de fluxo e por estudos de morfologia, verificou-se que o mecanismo de morte celular predominantemente observado após aplicação dos diferentes tratamentos foi a apoptose. Estes resultados sugerem que a terapia de génica suicida com HSV-TK/GCV ou CD/5-FC pode constituir uma nova abordagem com potencial terapêutico no CHC não só em monoterapia, mas também, em associação com as terapias convencionais ou novos fármacos dirigidos a alvos moleculares.

HCC is a deadly cancer whose incidence has increased dramatically over the past decades. Although many studies have been made and protocols investigated to treat HCC, the mortalilty rate of patients with advanced HCC is still high, so, there is an unmet need for new drugs, or new treatment options either as a single agents or in combination. This lack of safe and efficient therapeutic options against many types of cancer is encouraging the development of new gene therapy applications. Suicide gene therapy involves the delivery of a suicide gene into target cells, making them sensitive to an appropriate prodrug being the most commonly used Herpes Simplex Virus thymidine kinase (HSV-TK)/ ganciclovir (GCV) and the bacterial cytosine deaminase (CD)/ 5-fluorocytosine (5-FC) systems. This delivery can be made by viral or non-viral vectors. However, due to the problems involving the use of viral vectors, namely regarding safety issues, cationic liposomes emerged as promising systems due to their low toxicity and immunogenicity, lack of pathogenicity and versatility. The aim of the present study is to test the in vitro therapeutic potential in HCC cell lines (HUH-7 and Hep-G2), of suicide gene approaches (HSV-TK/ GCV or CD/ 5-FC), in monotherapy and in combination with conventional anticarcinogenic agents (doxorrubicin) and new targeted drugs (proteassome inhibitor MG-262), using liposomes coupled with transferrin. Viability was assessed by Alamar Blue assay and death mechanisms were verified by flow cytometry with AV/PI, morphology in smears stained with May-Grünwald-Giemsa and cell cycle analyses. Our results showed that suicide gene therapy using HSV-TK/GCV or CD/5-FC systems, resulted in a decreased viability, depending on the respective pro-drug dose and incubation time in HCC cell lines in culture. Combinations of these systems with lower doses than the IC50 of MG-262 or Doxorubicin enhanced the antiproliferative and cytotoxic effect meaning lower doses of other drugs with potentiation of the results and reduced toxicity levels and side effects. This antiproliferative effect was in agreement with the observed cell cycle alterations (accumulation in G2/M phase) upon applications of the suicide gene systems alone or in combination with doxorubicin and proteasome inhibitor. By flow cytometry and morphology studies, we observed that the mechanism of cell death was apoptosis upon application of the different treatments. These results suggest that suicide gene therapy with HSV-TK/GCV or CD/5-FC may constitute a new potential therapeutic approach in HCC not only in monotherapy, but also in association with conventional therapies or new targeted drugs.