Estudo da Cinética do Ferro na Doença Hepática Alcoólica. Papel da Hepcidina e das Mutações HFE

Abstract

O ferro é um micronutriente essencial ao metabolismo humano. Há cerca de uma década, foi identificado um péptido de síntese hepática, denominado hepcidina, sendo este o principal regulador da libertação do ferro dos enterócitos, hepatócitos e células do sistema retículoendotelial para o plasma, através da inibição do único exportador celular de ferro conhecido, a ferroportina-1. Posteriormente, descobriu-se que a expressão da hepcidina correlacionavase positivamente com a concentração hepática de ferro, com os níveis de hemoglobina e com a função hepática, e concluiu-se que a regulação da síntese de hepcidina é extremamente complexa e ocorre apenas a nível transcricional. Os principais sinais estimuladores são a inflamação e a sobrecarga de ferro, enquanto que a anemia, a hipóxia, e a sinalização da atividade dos percursores eritroides a inibem. No que respeita à relação entre consumo de álcool e sobrecarga de ferro, esta é bem conhecida há muitos anos. No entanto, o mecanismo exato pelo qual a sobrecarga de ferro ocorre na DHA nunca foi completamente caracterizado. Recentemente, em trabalhos de experimentação animal, verificou-se que o etanol provocava uma diminuição da expressão da hepcidina. Ainda não existem dados disponíveis na literatura no que respeita ao ser humano. Em vários trabalhos publicados sobre a relação entre polimorfismos do gene HFE e sobrecarga de ferro / evolução da DHA, as conclusões são díspares. O objetivo principal do nosso estudo foi o de testar as seguintes hipóteses: A fisiopatologia da sobrecarga de ferro na DHA em humanos resulta de: 1 - Presença de mutações do gene HFE; 2 - Alterações da transcrição da hepcidina. Propusemo-nos a efetuar a avaliação destes parâmetros em doentes com DHA (casos), e a compará-los com controlos saudáveis. Materiais e Métodos: Foram colhidas amostras de tecido hepático, quer em doentes com DHA, quer em indivíduos admitidos para colecistectomia eletiva por litíase vesicular não complicada. Procedeu-se à quantificação do ARN mensageiro da hepcidina por técnica de RT-PCR nessas amostras. As amostras dos casos foram também submetidas a exame histopatológico com avaliação semiquantitativa dos depósitos de ferro. Efetuámos também um estudo laboratorial de rotina, com inclusão dos parâmetros da cinética do ferro, a genotipagem HFE e a quantificação das subpopulações linfocitárias por citometria de fluxo. Nos casos, avaliámos a concentração de ferro hepático por RMN, usando o protocolo da Universidade de Rennes. Resultados e Conclusões: Não encontrámos diferenças significativas na distribuição das mutações HFE entre casos e controlos. Dividindo os casos em dois subgrupos, com pelo menos uma mutação HFE, e os restantes com genótipo wild type, verificámos que os primeiros apresentam depósitos significativos de ferro hepático com uma frequência mais elevada do que os wild type, para além de uma tendência para valores de ferritina mais elevados. Aquelas mutações não pareceram contudo conferir qualquer risco acrescido para a existência de fibrose significativa ou atividade necroinflamatória. Na aferição da concentração de ferro hepático por RMN, verificámos que os valores medidos por este método apresentaram uma alta força de associação com o grau histológico de depósitos de ferro e com a ferritina sérica. Dividindo os doentes em abstémios ou com alcoolismo ativo, verificámos que a atividade necroinflamatória era superior no segundo grupo, bem como a concentração de ferro hepático e a ferritina sérica. A existência de alcoolismo ativo foi a variável que maior risco relativo apresentou para a elevação da ferritina sérica. Quanto à avaliação das subpopulações linfocitárias, encontrámos uma linfopenia significativa no grupo dos casos, comparativamente com os controlos. Verificámos nos casos uma redução muito significativa em todas as subpopulações (CD3+, CD4+, CD8+, CD19+), exceto nos linfócitos NK. Proporcionalmente, a maior redução foi encontrada nos linfócitos CD8+, evidenciada por um aumento da relação CD4+/CD8+ nos casos comparativamente com os controlos. Esta relação apresenta uma correlação significativa com o grau de fibrose hepática. No que respeita às técnicas de RT-PCR, demonstrámos que a expressão genética relativa da hepcidina nos casos se encontrava significativamente diminuída comparativamente com os controlos, contrariamente aos valores de ferritina sérica e de saturação da transferrina, significativamente mais elevados. Para avaliar se a expressão de hepcidina era afetada por uma diminuição da capacidade biossintética do fígado, subdividimos os casos consoante a existência de fibrose em ponte ou cirrose, ou graus de fibrose menos graves, verificámos que a transcrição da hepcidina é significativamente inferior nos doentes com fibrose mais avançada, o que foi confirmado em análise multivariada. Para avaliar ainda o efeito que a ingestão de álcool tinha na expressão hepática da hepcidina, selecionámos apenas os casos com alcoolismo ativo e sem cirrose documentada histologicamente, com função hepática preservada, e comparámo-los com os controlos. Demonstrámos também neste grupo a diminuição da expressão da hepcidina em relação aos controlos. Em conclusão, apesar do quadro de sobrecarga de ferro traduzido por níveis significativamente mais elevados de ferritina sérica e de saturação da transferrina, os casos apresentaram uma expressão inapropriadamente baixa de hepcidina a nível hepático. Isto traduz claramente uma falência do mecanismo homeostático de regulação do ferro corporal. Pensamos que quer a diminuição da capacidade biossintética do fígado, quer a ingestão ativa de bebidas alcoólicas, são responsáveis por uma diminuição da transcrição da hepcidina. Esta diminuição afigura-se-nos como o mecanismo principal para a sobrecarga de ferro na DHA.

Introduction and Aims: Iron is an essential trace element in human metabolism. Nearly one decade ago, a liver synthetized peptide was identified and named hepcidin. It is the main regulator of iron release from enterocytes, hepatocytes and reticuloendothelial system cells to plasma, through the inhibition of the only known cellular iron exporter, ferroportin-1. Hepcidin levels were found to correlate with hepatic iron stores, hemoglobin levels, and liver function. Hepcidin synthesis regulation is exceedingly complex and regulated at the transcriptional level by stimulatory signals – inflammation, iron load, and cellular stress – and inhibitory signals – hypoxia, anemia, and iron deficiency. The relation between iron overload and alcoholic liver disease (ALD) has been well known for many years, however, the mechanism of iron overload in this disease is not clear. Recently, in animal experiment studies, it was found that ethanol caused a decreased expression of hepcidin messenger RNA. There is no data available in the literature with regard to this mechanism in humans. In several published studies on the relation between HFE polymorphisms and iron overload / ALD progression, conclusions are mixed. The main objective of our study was to test the following hypotheses: The pathophysiology of iron overload in DHA in humans is due to: 1 - Presence of HFE mutations; 2 - Changes in hepcidin transcription. We set out to undertake an evaluation of these parameters in ALD patients and to compare them with healthy controls. Materials and Methods: Liver samples were collected from ALD patients (cases) and from patients admitted for elective cholecystectomy because of noncomplicated gallstones (controls). Hepatic expression levels of hepcidin were determined by RT-PCR. Cases' liver samples underwent histopathological evaluation including semiquantitative iron stores assessment. Cases and controls underwent a routine laboratory evaluation for liver diseases including blood iron parameters. HFE genotyping and lymphocyte population subsets measurement by flow cytometry were performed. Liver iron content measurement by MRI, using University of Rennes' protocol, was performed in cases. Results and Conclusions: With regard to HFE mutations, we found no significant differences in genotype distribution between cases and controls. Considering cases only, we divided them into two subgroups: those with at least one HFE mutation, and the remaining wild type genotypes. ALD patients with at least one HFE mutation presented significantly higher iron stores in liver biopsy. There was also a tendency to higher serum ferritin values. However, the presence of those mutations did not seem to have any influence on the disease severity, as there were not any differences in fibrosis grade or necroinflammatory activity. Assessing iron deposits in ALD patients, we found that MR liver iron concentration measured values had a strong association with iron deposits histological grade and with serum ferritin values. The variable that was mostly associated with elevated serum ferritin was the presence of active alcoholism. Dividing patients into 2 groups - without and with active alcoholism at the time of the study, we found that necroinflammatory activity presence, MRI measured liver iron concentration and serum ferritin were significantly higher in the second group. We proceeded to compare lymphocyte population subsets between ALD patients and healthy controls. We found significant lymphopenia in patients. Analysing lymphocyte subpopulations, we found a significant reduction in all subsets (CD3+, CD4+, CD8+, CD19+), except in NK lymphocytes. This reduction was proportionally higher in CD8+ lymphocytes, evidenced by an increased CD4+/CD8+ ratio. This ratio presents a significant association with fibrosis grade. Evaluating hepcidin mRNA expression in liver samples has shown that gene expression was significantly lower in cases compared to controls. This was associated with significantly higher serum ferritin and transferrin saturation values in cases. We subdivided patients group, according to the existence or not of histologically proven bridging fibrosis or cirrhosis, in order to assess if hepcidin expression was affected by impaired liver function. We found that hepcidin transcription was significantly lower in patients with advanced fibrosis. This was confirmed in multivariate analysis. We intended to further evaluate the effect of alcohol intake in hepcidin liver expression. For that, we selected only cases with active alcoholism and without cirrhosis and no impaired liver function, and then compared them with controls. We again demonstrated that hepcidin expression was significantly reduced in that group. In conclusion, considering that iron overload was significant, with elevated serum ferritin and transferrin saturation levels, patients hepcidin expression levels were inappropriate low, implying a failure in the homeostatic mechanism of iron regulation by allowing increased intestinal absorption. We believe that both the reduced liver biosynthetic capacity caused by fibrosis and active ingestion of alcohol are responsible for the reduction of hepcidin gene transcription. This decrease appears to us as the primary mechanism for iron overload in ALD.