Assessment of the regenerative capacity in models of spinal cord injury

Abstract

Spinal cord injuries are amongst the most serious and debilitating health conditions with devastating impact on a patient´s life style, affecting not only its physical but also its psychological status and social life. The correct functioning of the nervous system depends on the formation of a complex pattern of connections during development. If these connections are subsequently lost through injury or degeneration, axons in the adult central nervous system fail to regenerate, which is a major clinical challenge. One of the main therapeutic strategies for spinal cord injury is to promote axonal regeneration. Thus, the use of experimental animal models of spinal cord injury is increasing. To allow the identification of molecular mechanisms responsible for axonal regeneration, our group has been using the conditioning lesion model, aiming at understanding the cellular and molecular mechanisms underlying the improvement of the regenerative capacity of central nervous system axons after a primary injury in the peripheral nervous system. This model is based on the fact that in dorsal root ganglion neurons, when an injury to the peripheral branch occurs before an injury to the central branch, the central branch gains regenerative capacity being able to grow through the glial scar. In this work we performed the validation of this model in rodents (mice and rats) and investigated the role of GSK-3β in promoting axonal regeneration. Our initial strategy was to assess the functional recovery of rats after spinal cord injury or conditioning lesion and, by retrograde labeling, evaluate, in vivo, the regeneration of central branch dorsal root ganglion axons. We established successfully the procedures of conditioning lesion and spinal cord injury in our animal facility, and developed a detailed post-surgical care of the paraplegic animals. Moreover, we confirmed the conditioning lesion effect in the ascending dorsal column tract axons by showing that they are capable of regenerating following conditioning lesion. Glycogen Synthase Kinase 3β (GSK-3β) has been described as playing a central role in regulating axon genesis and elongation. The phosphorylation of GSK-3β Tyr216 results in the activation of the kinase, while the phosphorylation of Ser9 leads to its inactivation. Given the critical functions that have been attributed to GSK-3β in the context of axonal growth, the modulation of its activity may be an important strategy for developing successful therapies for central nervous system injuries. To elucidate the role that inactivation of GSK-3β might play in the promotion of axonal regeneration, we tested several injury models in homozygous GSK-3 Ser21Ala/Ser9Ala knockin (GSK-3 KI) mice. In these mice, inactivation of GSK-3 through the phosphorylation of these residues is disabled. Through retrograde labeling of regenerating axons, we compared axonal regeneration in wild type and GSK-3 KI mice after spinal cord injury and conditioning lesion. Qualitative analyses led us to conclude that the conditioning lesion effect occurs independently of GSK-3β inactivation through Ser9 phosphorylation. However, further studies will be necessary to elucidate the role of this kinase in central nervous system regeneration. In summary, currently, all the tools are available in our laboratory to evaluate functionally and at the molecular level the identity of the molecules involved in axonal regeneration and therapeutic approaches for spinal cord injury in mouse and rat models.

As lesões na medula espinal encontram-se entre os mais sérios e debilitantes problemas de saúde, com um impacto devastador no estilo de vida de uma pessoa, afectando não só o seu estado físico e psicológico, mas também a sua vida social. O correcto funcionamento do sistema nervoso depende da formação de complexas ligações nervosas durante o desenvolvimento embrionário. Se estas ligações forem perdidas após lesão ou degeneração, os axónios do sistema nervoso central adulto não conseguem regenerar, o que se tem revelado um grande desafio. Uma das principais estratégias em lesões medulares é promover a regeneração axonal. Assim, o uso de modelos animais experimentais, de lesões na medula espinal, tem vindo a aumentar. Para permitir a identificação de mecanismos moleculares responsáveis pela regeneração axonal, e visando comprender os mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao aumento da capacidade regenerativa em axónios do sistema nervoso central, após uma lesão primária no sistema nervoso periférico, o nosso grupo tem vindo a utilizar o modelo de lesão condicionante. Este modelo baseia-se no facto de que, em neurónios do gânglio da raiz dorsal, quando uma lesão no ramo periférico ocorre antes de uma lesão do ramo central, a capacidade regenerativa do ramo central aumenta, tornando-se capaz de crescer através da cicatriz glial. Neste trabalho efectuámos a validação deste modelo em roedores (ratos e murganhos) e investigámos o papel da GSK-3β na promoção da regeneração axonal. A nossa estratégia inicial foi avaliar a recuperação funcional de ratos após lesão da medula espinal ou lesão condicionante e, através de marcação retrógrada, avaliar, in vivo, a regeneração de axónios do ramo central do gânglio da raiz dorsal. Conseguimos estabelecer, com sucesso, os procedimentos para a lesão condicionante e para a lesão medular no nosso biotério, e desenvolvemos cuidados pós-cirúrgicos detalhados para com os animais paraplégicos. Além disso, confirmámos o efeito da lesão condicionante no tracto ascendente de axónios dorsais, mostrando que são capazes de regenerar após lesão condicionante. A Glycogen Synthase Kinase 3β (GSK-3β) tem sido descrita como tendo um papel central na regulação da elongação e da genese axonal. A fosforilação da Tyr216 GSK-3β resulta na activação da cinase, enquanto a fosforilação da Ser9 leva à sua inactivação. Dadas as funções que têm sido atribuídas à GSK-3β, no contexto do crescimento axonal, a modulação da sua actividade pode ser uma estratégia importante para o desenvolvimento de terapias para lesões do sistema nervoso central. Para elucidar o papel que a inactivação de GSK-3β pode desempenhar na promoção da regeneração axonal, testámos vários modelos de lesão em murganhos homozigóticos GSK-3 Ser21Ala/Ser9Ala knockin (GSK-3 KI). Nestes animais, a inactivação da GSK-3 através da fosforilação destes resíduos está desactivada. Através da marcação retrógrada de axónios em regeneração, comparámos a regeneração axonal em murganhos wild type e GSK-3 KI após a lesão medular e lesão condicionante. Análises qualitativas levaram-nos a concluir que o efeito da lesão condicionante ocorre independentemente da inactivação da GSK-3β pela fosforilação da Ser9. No entanto, mais estudos serão necessários para elucidar o papel desta cinase na regeneração do sistema nervoso central. Resumindo, actualmente, o nosso laboratório dispõe de todas as ferramentas necessárias, para avaliar funcionalmente e ao nível molecular quais as moléculas envolvidas na regeneração axonal, e abordagens terapêuticas para lesões da medula espinal em ratos e murganhos.