Role of PKCϒ cleavage and aurophagy in protein aggregation and clearance : spinocerebellar ataxia type 14 as a neurodegeneration model

Abstract

Neurodegeneration affects specific subtypes of neurons in particular functional anatomic systems, causing a heterogeneous clinical and pathological expression. Signal transduction deregulation, alteration of calcium homeostasis along with quality control systems failing often contribute to, or even directly underline these neurodegenerative processes. Although their significance is still debated, protein aggregates or other atypical protein assemblies seem to be both the common feature and strongly implicated in disorders like spinocerebellar ataxias (SCAs), Huntington’s, Parkinson’s or Alzheimer’s disease. The SCAs compose a group of heterogeneous genetic disorders both clinical and genetically, mainly characterized by progressive degeneration of the cerebellum. Clinically, the patients show imbalance, progressive gait and limb ataxia, dysarthria and dysphagia. Missense mutations in the brain-specific gamma isoform of protein kinase C (PKCγ) are the cause of spinocerebellar ataxia type 14 (SCA14), and have been shown to be prone to aggregation. SH-SY5Y cells were used to generate the cellular SCA14 models, and PKCγ expression was assessed through western-blot, real-time PCR (for mRNA expression) and immunocytochemistry. In order to study the influence of PKCγ proteolysis by calpains and macroautophagy activation on PKCγ aggregation, calpain inhibition was achived through calpastatin co-transfection, and mTOR inhibition by treatment with rapamycin. Here, we show the successful establishment and characterization of two cellular models for SCA14, one transient and another stably expressing both wild-type and mutant PKCγ. We demonstrate, for the first time, that calpain inhibition significantly reduces aggregate formation and increases cell survival, pointing to a role of PKCγ proteolysis in protein turn-over and aggregation. Our preliminary data also point for a wide role of rapamycin in PKCγ aggregate clearance, and further discuss the possibility of both these ameliorating effects being mediated and converge in autophagy activation, as well as the importance of the C1 regulatory domain in aggregate formation.

A neurodegeneração afecta conjuntos particulares de neurónios em sistemas anatómicos e funcionais específicos, dando origem a uma expressão clínica e patológica heterogénea. A estes processos, estão muitas vezes associados ou mesmo subjacentes, fenómenos que envolvem desregulação da transdução de sinal, alterações na homeostase do cálcio assim como falha dos sistemas de controlo de qualidade. Embora, o seu papel e importância ainda sejam muito debatidos, os agregados proteicos e outros conjuntos atípicos de proteínas, são características comuns e fortemente implicadas em várias doenças como ataxias espinocerebolosas (SCAs), e doenças de Huntinton, Parkinson e Alzheimer. As SCAs compreendem um grupo heterogénio de doenças genéticas tanto do ponto de vista clínico como genético, characterizadas degeneração progressiva do cerebelo. Clinicamente, os doentes apresentam desequilíbrio, ataxia progressiva da marcha e dos membros, disartria e disfagia. Mutações pontuais na isoforma gama da proteína cinase C (PKCγ), causam ataxia espinocerebolosa do tipo 14 (SCA14), tendo já sido demonstrado que têm a capacidade de agregar. A linha SH-SY5Y foi utilizada para gerar modelos celulares de SCA14, e a expressão da PKCγ foi avaliada através de western-blot, PCR em tempo real (para expressão de mRNA) e imunocitiquímica. Para estudar a influencia da proteólise da PKCγ pelas calpaínas, e a activação da macroautofagia sobre a agregação da PKCγ, foram realizadas co-transfecções com calpastatina e o mTOR foi inibido através do tratamento com rapamicina. Aqui, mostramos a caracterização de dois modelos celulares para SCA14, um com expressão transiente e outro com expressão estável de PKCγ normal e mutada. Pela primeira vez, demonstramos que a inibição das calpaínas leva a uma redução significativa da formação de agregados, aumentando a sobrevivência celular, o que aponta para um papel importante da degradação da PKCγ no turn-over proteico e agregação. Os nossos dados preliminares também apontam para um efeito alargado da rapamicina sobre a remoção dos agregados, sendo que vamos mais além, e discutimos a possibilidade de ambos os efeitos serem mediados, e convergirem, na activação da autofagia, assim como a importância que o domínio regulador C1 tem, na formação de agregados.