Noninvasive Measurements of Human Hepatic Metabolism Using Deuterated Water. Influence of Deuterium Exchange Processes on Metabolic Flux Estimates

Abstract

Diabetes mellitus is characterized by a loss of whole-body glucose homeostasis resulting from impaired insulin secretion (type 1 diabetes mellitus -T1DM) and/or insulin sensitivity (type 2 diabetes mellitus -T2DM). The liver plays a key role in glucose homeostasis through a metabolic network that converts glucose and other carbohydrates to glycogen during feeding and sustains whole body glucose demands during fasting. Since these activities are tightly controlled by insulin, a deficiency or inaction of insulin results in deregulated hepatic glucose metabolism that is incompatible with the supply and demand of whole body glucose over the daily feeding-fasting cycle. In this Thesis, normal and deregulated liver glucose metabolism in human subjects was characterized by stable isotope tracers and noninvasive assays of hepatic metabolite enrichments from these tracers using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy. Chapter 1: A general introduction is presented in this Chapter focused in Diabetes mellitus. Hepatic glucose metabolism and an overview to its regulatory aspects are presented. Disruption of glucose fluxes in T1DM, T2DM and Insulin Resistance are described. Molecular mechanisms of insulin signaling and T2DM therapy are briefly overviewed. The use of isotopes to study the hepatic metabolism is underlined in this Chapter as well the importance of the use of xenobiotics to noninvasively address glucose and protein metabolism. Chapter 2: Hepatic glycogen synthesis following a breakfast meal that included milk was evaluated in healthy subjects using deuterated water (2H2O) and [1-13C]glucose tracers for resolving the contributions of galactose, direct, and indirect pathways to glycogen synthase flux. The completeness of hepatic glucose-6-phosphate-fructose-6-phosphate (G6P-F6P) exchange was confirmed using [U-2H7]glucose hence the dilution of the 2H label in position 2 could be completely attributed to galactose metabolism. Transaldolase (TA) exchange activity was also measured. Its influence on the direct and indirect pathway contributions derived from the 2H2O method was evaluated and compared with data obtained from [1-13C]glucose – this latter tracer being insensitive to TA exchange activity. Analysis of carbon-13 (13C) and deuterium (2H) was addressed by NMR spectroscopy. Chapter 3: The presence of hepatic TA exchange activity was determined in a group with normal fasting glucose/normal glucose tolerance (NFG/NGT) subjects, in a group with impaired fasting glucose/impaired glucose tolerance (IFG/IGT) and in a group with impaired fasting glucose/normal glucose tolerance (IFG/NGT) subjects. TA measurements were determined by infusing [1-13C]acetate. Glucose and glucuronide 13C-enrichments were analyzed by 13C NMR. TA increases the label of position 5 of glucose independently of gluconeogenic activity when deuterated water method is used. This overestimates the contribution of gluconeogenic fraction to glucose production. The contribution of gluconeogenesis and glycogenolysis to endogenous glucose production (EGP) was determined after an overnight fasting for the three groups using 2H2O. The values obtained were corrected for TA exchange activity resulting in a significantly decreased gluconeogenic fraction and a significantly increased glycogenolytic contribution. Also 2H3/2H2 ratios were compared with the 2H5/2H2 ratios corrected for TA exchange. Chapter 4: Recently, whole-body protein turnover kinetics have been shown to be altered in the insulin resistant state resulting in an increased availability of amino acids such as glutamine for hepatic gluconeogenesis and therefore an increased potential for excessive hepatic glucose production. A reduction in the anabolic action of insulin is anticipated to result in elevated appearance of whole-body glutamine from proteolysis compared to its metabolic synthesis from the Krebs cycle. The contribution of proteolytic and metabolic sources to hepatic glutamine was determined in healthy subjects. They were studied after ingestion of 2H2O following an overnight fast and hepatic glutamine was noninvasively sampled as urinary phenylacetylglutamine (PAGN) using phenylbutyrate. The enrichment of this sampled glutamine from 2H2O provided a measure of metabolic and proteolytic contributions. These studies demonstrate that even for healthy insulin sensitive subjects, proteolysis accounts for a significant fraction of hepatic glutamine.

A diabetes mellitus caracteriza-se pela perda da regulação da homeostase da glicose devido a alterações na secreção de insulina (diabetes mellitus tipo 1 -T1DM) e/ou na sensibilidade à insulina (diabetes mellitus tipo 2-T2DM). O fígado desempenha um papel chave nesta regulação através de uma rede metabólica que converte a glicose e outros hidratos de carbono em glicogénio no estado pós-prandial enquanto durante o jejum assegura as necessidades fisiológicas de glicose. Sendo estes processos estritamente controlados pela insulina, a deficiência em insulina ou alterações na sua acção, resultam na perda da regulação do metabolismo hepático da glicose durante o ciclo diário de pós-prandial/jejum. Nesta Tese, o metabolismo hepático da glicose foi caracterizado em indivíduos saudáveis ou pacientes com alterações da acção da insulina, por espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) usando marcadores de isótopos estáveis e métodos não invasivos. Capítulo 1: Uma introdução geral é apresentada neste Capítulo, focando a Diabetes mellitus. O metabolismo hepático da glicose e uma visão geral da sua regulação são apresentados. Alterações dos fluxos hepáticos da glicose em T1DM, T2DM e na insulino-resistência são descritos. Os mecanismos da sinalização da insulina e da terapia em T2DM são brevemente abordados. O uso de isótopos no estudo do metabolismo hepático foi sublinhado neste Capítulo assim como a importância do uso de xenobióticos para estudar de um modo não invasivo o metabolismo da glicose e proteico. Capítulo 2: A síntese hepática de glicogénio após ingestão de um pequeno almoço que inclui leite, foi avaliada em indivíduos saudáveis usando o método da água deuterada (2H2O) e o método da [1-13C]glicose, para determinar a contribuição da galactose, via directa e indirecta para o fluxo a nível da enzima glicogénio sintetase. A completa extensão da inter-conversão entre a glicose-6-fosfato e a frutose-6-fosfato (G6P-F6P) hepáticas foi confirmada usando [U-2H7]glicose e assim a diluição da marcação em deutério na posição 2 pode ser completamente atribuída ao metabolismo da galactose. A actividade da transaldolase (TA) foi também determinada. A sua influência na contribuição das vias directa e indirecta para a síntese de glicogénio foi avaliada através do método da 2H2O e os resultados foram comparados com os valores obtidos com o método da [1-13C]glicose, que é insensível à acção da TA. A análise de carbono-13 (13C) e deutério (2H) foi feita por espectroscopia de RMN. Capítulo 3: A presença da actividade da TA hepática foi determinada num grupo de indivíduos com valores normais de glicose em jejum/tolerância normal à glicose (NFG/NGT), num grupo com valores alterados da glicose em jejum/alteração da tolerância à glicose (IFG/IGT) e num grupo com valores alterados da glicose em jejum/tolerância normal à glicose (IFG/NGT). As medições da actividade da TA foram determinadas por infusão de [1-13C]acetato. Os enriquecimentos em 13C e em 2H da glicose e do glucuronato foram analisados por espectroscopia de RMN. A actividade da TA aumenta a marcação da posição 5 da glicose independentemente da actividade gliconeogénica resultando numa sobrestimava da contribuição da fracção gliconeogénica na produção de glicose. A contribuição da gliconeogénese e da glicogenólise para a produção endógena de glicose foi determinada após um jejum nocturno nos três grupos de indivíduos pelo método da 2H2O. Os valores obtidos foram corrigidos tendo em conta o efeito da actividade da TA resultando numa redução significativa da fracção gluconeogénica num aumento significativo da contribuição da glicogenólise. Também as razões 2H3/2H2 foram comparadas com as razões 2H5/2H2 previamente corrigidas para a actividade da TA. Capítulo 4: Recentemente verificou-se que a cinética de turnover proteico global está alterada em situações de insulino-resistência. Esta alteração resulta num aumento da disponibilidade de aminoácidos, tais como a glutamina, para a gliconeogénese hepática e num potencial aumento da produção hepática de glicose. Provavelmente, o aumento do aparecimento de glutamina dever-se-á principalmente a uma elevada proteólise relativo à sua síntese metabólica derivada do ciclo de Krebs. As contribuições de fontes proteolíticas e metabólicas para a glutamina hepática foram determinadas de uma forma não-invasiva em indivíduos saudáveis utilizando água deuterada e fenilbutirato. Após um jejum nocturno, a glutamina hepática foi obtida a partir de fenilacetilglutamina urinária e o enriquecimento proveniente da 2H2O quantificado por espectroscopia de RMN. Estes estudos demonstraram que mesmo em indivíduos saudáveis e sensíveis à insulina, a proteólise contribui com uma fracção significativa para a glutamina hepática. Finalmente, no último Capítulo, os principais resultados obtidos nesta Tese foram resumidos.