Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/17964
Title: Strategies for the improvement of Arbutus unedo L. (strawberry tree) : in vitro propagation, mycorrhization and diversity analysis
Authors: Gomes, Maria Filomena Figueiredo Nazaré 
Orientador: Canhoto, Jorge Manuel Pataca Leal
Keywords: Arbutis unedo
Issue Date: 2011
Citation: GOMES, Maria Filomena Figueiredo Nazaré - Strategies for the improvement of Arbutus unedo L. (strawberry tree) : in vitro propagation, mycorrhization and diversity analysis. Coimbra : [s.n.], 2011
Abstract: Arbutus unedo grows spontaneously around the Mediterranean basin. The species is drought tolerant and able to regenerate following forestry fires making it quite interesting for forestation programs in Mediterranean regions. Fruits are used to make jellies and a spirit which represents the main income for owners. Considering the sparse information about the potential of this fruit tree to be propagated in vitro, a project to clone selected trees based on their fruit production was initiated. The role of several factors on propagation was evaluated and studies concerning the mycorrhization and genetic diversity analysis were also performed. Shoot apices from epicormic shoots showed higher rates of in vitro establishment. Of the three basal media tested, the Fossard medium with the micronutrients of the Murashige and Skoog medium gave the highest rates of multiplication. Kinetin (8.9 μM) gave the best results although not different (P>5%) from those obtained with other cytokinins such as benzyladenine or zeatin. Thidiazuron or 1-naphthaleneacetic acid promoted callus growth and had a deleterious effect on the multiplication rate. The genotype was also a factor affecting in vitro multiplication and the conditions used for shoot multiplication greatly influenced further behaviour of shoots during the rooting phase. In this phase, the inclusion of an auxin significantly increased rooting yields. Anatomical studies data indicated that adventitious roots had a deep origin in the shoot stem, probably from the cambial zone. From the five substrates tested during acclimatization, perlite without fertilizer gave the best survival rate (98.0±1.23%) after 4 months. Mycorrhization was tested in vitro and under nursery conditions. Arbutoid mycorrhizae were observed in vitro 1 month after inoculation indicating compatibility between A. unedo and Pisolithus tinctorius. Both mycorrhizae inocula treatments tested in nursery (vegetative inocula and dry sporocarps) improved plant growth compared to control plants and seedlings after 20 months in a field trial (P>5%). The genetic diversity in 27 Arbutus unedo genotypes was assessed by molecular markers (RAPD and SSR). The RAPD primers generated 124 bands from which 57.3% showed to be polymorphic. Eleven SSR primers first tested in Vaccinium (an Ericaceae) were previously selected. Five SSR loci were polymorphic displaying a 75% mean expected heterozygosity which is a higher value than that observed with RAPDs (27%). Thus, the Lynch (1990) similarity coefficient revealed a similarity among trees higher for RAPD than SSR, respectively of 83% and 21% (Mantel test: r= 0.64; P<0.001; r=0.75; P<0.001, respectively). No genotypes could be grouped according to their geographical origin for both markers. Some of the produced plants are now in the field for further studies. The data presented in this thesis have provided protocols concerning the in vitro propagation of adult plants, mycorrhizal synthesis and allowed the identification of five polymorphic molecular markers (SSR), used on genetic diversity analysis of 27 genotypes. The results are discussed and further research envisaged.
A espécie Arbutus unedo cresce espontaneamente em áreas Mediterrânicas. Trata-se de uma árvore tolerante à secura e com forte capacidade regenerativa após a ocorrência de incêndios florestais, o que a torna interessante para programas de florestação na região Mediterrânica. Os frutos são usados na produção de compota e aguardente. Esta corresponde à principal fonte de rendimento para os proprietários. Considerando a escassa informação acerca do potencial desta espécie frutícola para a propagação in vitro, foi iniciado um projecto para a propagação de árvores seleccionadas de acordo com a sua produção de fruto. O efeito de diversos factores na propagação foi avaliado e estudos relativos à micorrização e à diversidade genética foram efectuados. Os ápices meristemáticos de rebentos epicórmicos apresentaram as melhores taxas no estabelecimento in vitro. De três meios de cultura base testados, o meio de Fossard adicionado de micronutrientes de Murashige e Skoog apresentou as maiores taxas de multiplicação. A citocinina cinetina (8.9 μM) permitiu obter as melhores taxas de multiplicação mas sem diferenças significativas relativamente à benziladenina ou zeatina. Tidiazurão ou o ácido 1-naftaleno acético induziram a formação de calos tendo um efeito nefasto na multiplicação. O genótipo foi também um dos factores que interferiu na multiplicação, tendo-se igualmente verificado que as condições testadas na multiplicação influenciaram o comportamento dos rebentos durante a fase de enraizamento. A inclusão de uma auxina aumentou significativamente o enraizamento. Estudos anatómicos mostraram que as raízes adventícias têm uma origem profunda no caule, provavelmente na zona cambial. De cinco substratos testados na aclimatização, a perlite sem fertilizantes foi a que permitiu obter uma maior taxa de sobrevivência após 4 meses (98.0±1.23%). A micorrização foi testada in vitro e no viveiro. Micorrizas arbutóides foram observadas in vitro 1 mês após a inoculação, mostrando a compatibilidade entre A. unedo e Pisolithus tinctorius. Ambos os tratamentos com inóculo testados no viveiro (inóculo vegetativo e caldo esporal) melhoraram o crescimento das plantas relativamente ao controlo e plantas de semente, 20 meses após a instalação do ensaio de campo (P>5%). A diversidade genética entre 27 genótipos de Arbutus unedo foi avaliada com recurso a marcadores moleculares (RAPD e SSR). No caso dos RAPDs os primers utilizados geraram 124 bandas, com 57,3% de polimorfismo. Onze primers SSR de Vaccinium (uma Ericaceae) foram previamente seleccionados. Cinco SSR loci mostraram polimorfismo, com uma heterozigocidade esperada média de 75%, um valor superior ao obtido com RAPDs (27%). Assim, o coeficiente de similaridade de Lynch (1990) mostrou uma similaridade entre as árvores maior com os marcadores RAPD do que com os marcadores SSR, respectivamente de 83% e 21% (Mantel test: r= 0.64; P<0.001; r=0.75; P<0.001, respectivamente). Nenhum genótipo pôde ser agrupado de acordo com a sua origem geográfica, para ambos os marcadores. Algumas das plantas produzidas foram instaladas em ensaios de campo. Os dados apresentados nesta tese permitiram estabelecer protocolos para a propagação in vitro de plantas adultas, para o estabelecimento de micorrizas e a identificação de cinco marcadores moleculares (SSR) polimórficos, utilizados na avaliação da diversidade genética entre 27 genótipos. Os resultados obtidos são discutidos e analisados em termos de perspectivas futuras.
Description: Tese de doutoramento em Biologia (Fisiologia) apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/17964
Rights: openAccess
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