Especificidade caseinolítica da protease de cynara cardunculus L

Abstract

As flores secas de Cynara cardunculus L. são utilizadas em Portugal no fabrico de vários tipos de queijo de ovelha. No entanto com leite de vaca obtêm-se defeitos de textura e sabor. Nesta dissertação estuda-se, a nível molecular, a acção da protease aspártica presente na flor de Cynara cardunculus L. sobre as caseínas as, k e ß bovinas e o modo com a especificidade caseinolítica contribui para os defeitos organolépticos de queijos de vaca preparados com este coalho vegetal. A proteólise das caseínas as, k e ß bovinas pela cardosina é seguida por rp-HPLC. São estabelecidas e optimizadas as condições experimentais para obtenção dos mapas peptídicos para cada caseína. Faz-se a identificação e caracterização dos peptídeos, identificam-se as ligações clivadas e determinam-se alguns parâmetros cinéticos. Os resultados são discutidos sob três aspectos: 1. Especificidade primária e secundária da cardosina e comparação com a de outras proteases aspárticas; 2. Análise da especificidade caseinolítica da cardosina com base na especificidade primária e secundária e nos modelos de estrutura tridimensional das caseínas; 3. Relação entre essa especificidade e qualidade do queijo, em cada uma das três fases gerais do processo de fabrico (coagulação, sinérese e maturação). A cardosina acomoda no local activo resíduos de Leu e Tyr em todos os sublocais de S4 a S'3 e de Phe e Trp em todos os sublocais de S3 a S'1, actuando, ao contrário da quimosina, em sequências muito volumosas e hidrófobas. Esta enzima é inibida por cargas positivas em posição P3 mas versátil em relação ao tamanho e hidrofobicidade do resíduo P3, funciona como dipeptidilpeptidase e peptidildipeptidase e, ao contrário da maioria das proteases aspárticas de vertebrados, fungos e retrovírus, não é selectiva em relação ao resíduo P2. A acção da cardosina sobre a k-CN não parece ter efeitos adversos na qualidade do queijo. O sabor amargo e os defeitos de textura estão provavelmente relacionados com a elevada actividade da cardosina nas regiões as1-CN Ala163-Trp-Tyr-Tyr-Val167 e ß-CN Ala189-Phe-Leu-Leu-Tyr193, respectivamente.

Dried flowers of the cardoon Cynara cardunculus L. are used for ewe's cheese making in Portugal. However, with cow's milk, texture and flavour defects result. The aim of this dissertation is to study, at a molecular level, the action of cardosin, the cardoon aspartic protease responsible for milk clotting, on as, k and ß bovine caseins and to contribute to the understanding of the organoleptic defects of cow's milk cheeses prepared with this vegetable rennet.

The proteolysis of as-, k- and ß- casein by the cardoon protease is followed by rp-HPLC. The experimental conditions for peptide mapping are established and optimized for each casein. The peptides are then identified and characterized, the cleavage sites are identified and some kinetic parameters determined.

The discussion of results concentrates on three aspects: 1. The primary and secondary specificity of cardosin and comparison with that of chymosin and other aspartic proteases; 2. The analysis of the caseinolytic specificity of cardosin, on the basis of its primary and secondary specificity and of the three dimensional molecular models of caseins and 3. The relationship between caseinolytic specificity and cheese quality, namely on each of the three main phases of the manufacturing process (coagulation, syneresis and ripening).

The active-site cleft of cardosin accommodates residues of Leu and Tyr in all S4 - S'3 subsites and residues of Phe and Trp in all S3 - S'1 subsites and, unlike chymosin, acts on rather bulky sequences. Cardosin is inhibited by positively charged residues at P3, is versatile in relation to size and hydrophobicity of P3, acts as dipeptidil peptidase and peptidil dipeptidase and, in contrast to most vertebrate, fungal and retroviral aspartic proteases, it is not selective in relation to P2.

The poor performance of cardosin in the production of cow milk-cheese does not seem to be due to its action on k-CN. The high activities of cardosin in the rather bulky, hydrophobic sequences of as1- CN (Ala163-Trp-Tyr-Tyr-Val167) and ß-CN (Ala189-Phe-Leu-Leu-Tyr193) likely contribute to the bitter taste and texture defects of cheese, respectively.