Efeitos dos métodos de hemólise e da pré-incubação com ATP na Ca+, composição lipo-proteica e orientação de vesículas membranares

Abstract

A problemática investigada e discutida nesta tese parte da ideia inicial de que as membranas dos eritrócitos têm sido largamente utilizadas como modelo para o estudo de membranas biológicas. Contudo, apesar de facilmente preparadas, as membranas obtidas por diferentes métodos apresentavam diferenças nalgumas características estruturais e funcionais. Assim, o objectivo inicial da tese foi o de investigar o efeito na Ca2+ ATPase e na composição lipo-proteica membranar de dois métodos de hemólise vulgarmente utilizados na preparação de membranas, respectivamente hemólise isotónica na presença de saponina e hemólise hipotónica na presença de Tris/EDTA. Subsequentemente, foi estudado o efeito da pré-incubação com ATP de membranas preparadas por hemólise hipotónica nos parâmetros acima referidos, uma vez que este tratamento é vulgarmente utilizado para a preparação de um modelo de membranas conhecido por membranas invertidas, o qual é particularmente útil para o estudo da bomba de Ca2+ da membrana plasmática. Resultados obtidos durante os estudos cinéticos da Ca2+ ATPase sugeriram a existência nestas membranas duma fosfatase estimulada por ATP e Ca2+ que actuava em componentes fosforilados da membrana. Estudos preliminares para a caracterização desta enzima bem como do seu substrato são incluídos neste trabalho. Finalmente, e ainda dentro da problemática da utilização de membranas de eritrócitos como modelo da membrana plasmática foram ainda investigados nesta tese o efeito da idade dos eritrócitos e dos métodos de conservação das membranas nos parâmetros acima referidos. Os resultados dos estudos respeitantes ao efeito do método de hemólise na Ca2+ ATPase e na composição lipo-proteica das membranas dos eritrócitos mostraram que a actividade da Ca2+ ATPase, o conteúdo em fosfatidilinositol 4,5 bifosfato e a susceptibilidade das proteínas à degradação durante o processo de manutenção das membranas eram mais elevadas em membranas preparadas pelo método de hemólise isotónica na presença de saponina do que em membranas preparadas pelo método de hemólise hipotónica na presença de Tris/EDTA. Porém, a elevada actividade da Ca2+ ATPase em membranas preparadas pelo método de hemólise isotónica era aparente pois durante os ensaios da actividade desta enzima e para baixas concentrações de ATP (0 a 0,3 mM) observou-se libertação de fosfato que não resultava do y-P do ATP. Este fosfato resultava sim da actividade dum fosfatase dependente de ATP e Ca2+ e da idade dos eritrócitos que era sensível ao número de lavagem das membranas, às condições e ao tempo da sua manutenção a 4oC e a -30oC. Contudo, não foi possível discernir se esta fosfatase actuava ou não no fosfatidilinositol 4,5 bifosfato das membranas. Os resultados dos estudos respeitantes ao efeito da pré-incubação na presença de ATP em membranas preparadas pelo método de hemólise hipotónica na presença de Tris/EDTA, nomeadamente as características de acumulação activa e ligação passiva de Ca2+, a acessibilidade da acetilcolinesterase, a distribuição dos aminofosfolípidos, a morfologia das membranas, o número de fracções obtidas por centrifugação das membranas num gradiente descontínuo de Dextrano T110 4 a 20% bem como a sua caracterização mostraram que este tratamento das membranas conduz à formação duma população heterogénea de vesículas enriquecida de outras com elevada capacidade de acumular Ca2+ activamente e reduzida acessibilidade da acetilcolinesterase. No entanto, não foi possível discernir se estas vesículas eram ou não vesículas invertidas. Dos resultados apresentados nesta tese concluíu-se que: 1. as membranas de eritrócitos preparadas pelo método de hemólise isotónica na presença de saponina e hemólise hipotónica na presença de Tris/EDTA diferiam na actividade da Ca2+ ATPase e da fosfatase dependente de ATP e Ca2+, no conteúdo em fosfatidilinositol 4,5 bifosfato e na susceptibilidade das proteínas à degradação; 2. a pré-incubação na presença de ATP de membranas de eritrócitos obtidas por hemólise hipotónica na presença de Tris/EDTA originava uma população heterogénea de vesículas no que se refere à sua morfologia, capacidade de acumulação activa de Ca2+ e acessibilidade da acetilcolinesterase.