Conformational and functional alterations on an aspartic proteinase promoted by trifluoroethanol

Abstract

O estudo das proteinases aspárticas tem vindo a ganhar interesse devido à importância desta classe de enzimas na etiologia e evolução de doenças humanas que são hoje fonte duma preocupação crescente, como são os casos da doença de Alzheimer, do cancro da mama ou da SIDA. A base molecular de algumas destas doenças está associada a erros de folding (enrolamento), que impossibilitam a sua função. Estudos de estabilidade sobre esta classe de enzimas são de extrema importância para a caracterização dos mecanismos patológicos envolvidos, e para a descoberta de soluções terapêuticas. A proteína heterodimérica cardosina A é uma proteinase aspártica de origem vegetal que pode ser purificada em elevadas quantidades. Apesar de tradicionalmente ser usada como agente coagulante do leite na produção de queijo, as suas características fizeram dela uma enzima interessante para aplicações biotecnológicas. Esta endopeptidase tem sido considerada um bom modelo para estudos estruturais e funcionais do grupo das proteinases aspárticas e de proteínas em geral. A disponibilidade de água é um factor fundamental para a estabilidade proteica e para a sua flexibilidade conformacional, características estas essenciais à sua função. Com o presente trabalho esperamos ter contribuído para a compreensão da conformação nativa das proteinases aspárticas como uma forma mutável. Ao longo dos últimos anos a estrutura conformacional da cardosina A foi caracterizada em sistemas bifásicos, meio aquoso saturado com solventes orgânicos, e mais exaustivamente na presença do solvente orgânico acetonitrilo. Na sequência do trabalho desenvolvido pelo nosso grupo, o unfolding (desenrolamento) da cardosina A foi induzido pelo 2,2,2-trifluoroethanol (TFE), um solvente orgânico polar e prótico com propriedade muito diferentes dos solventes orgânicos previamente usados. As características do TFE promovem alterações distintas na estrutura da água, interagindo de um modo particular com a camada de hidratação da proteína e com a própria estrutura proteica. Além disso o TFE é conhecido por estabilizar conformações complexas em vez de induzir a desnaturação. Foi objectivo do presente trabalho seguir as alterações conformacionais e funcionais promovidas pela proximidade do TFE à estrutura da cardosina A. A dependência da função enzimática em relação à estrutura proteica foi relacionada com a disponibilidade de água e/ou de pontes de hidrogénio na superfície da proteína. Diferentes métodos espectroscópicos (dicroísmo circular e fluorescência intrínseca), medições de actividade enzimática, e análise calorimétrica foram utilizados para detectar e caracterizar os estados induzidos pelo solvente orgânico. Finalmente foram aplicadas ao sistema simulações de dinâmica molecular/mecânica molecular (MD/MM) de forma a compreender a interacção entre a proteína e as moléculas de solvente. Os ensaios in vitro com a cardosina A em TFE promoveram variações de folding dependentes da concentração do álcool. Concentrações de TFE inferiores a 4% diminuíram a estabilidade proteica, mas aumentaram reversivelmente a actividade enzimática. Concentrações superiores a 20% de TFE no meio inactivaram irreversivelmente a enzima e desenrolaram a sua estrutura terciária, enquanto o seu conteúdo secundário em hélices foi progressivamente aumentado (principalmente de segmentos sem estruturação prévia). Por último, concentrações superiores a 70% de TFE no meio inactivaram a enzima e promoveram um vasto aumento na complexidade estrutural, na forma típica de estruturas helicoidais abertas, alterações estas que provaram ser reversíveis. As simulações de MD com TFE e água, descreveram alterações locais de flexibilidade proteica, mas sem grandes transformações conformacionais. Em vez disso o modelo expôs os locais de competição entre o TFE e as moléculas de água da superfície de solvatação. Moléculas de TFE foram encontradas a substituir várias moléculas de hidratação no local activo. Apesar da molécula de água catalítica não ter sido perdida na última conformação adquirida na simulação para alto conteúdo em TFE, o local activo apresentava-se ocupado por várias moléculas de TFE, e este facto foi proposto como justificação para a perda de actividade. A mesma lógica poderá explicar a recuperação de actividade após a diluição para sistema aquoso, com a libertação do local activo para interacção com o substrato.

The study of aspartic proteases has been gaining interest due to their importance in the development of major concerning human diseases, as Alzheimer’s disease, breast cancer, or AIDS. The molecular basis of some of these diseases is associated to folding errors, which disables proteins proper functioning. Stability studies over this class of enzymes are extremely important for characterising the pathology involved mechanisms and to discover therapeutic solutions. The heterodimeric cardosin A is a plant aspartic proteinase of high yield purification. Besides having been traditionally used as milk clotting agent for cheese making, its characteristics have made it an interesting enzyme for biotechnological applications. This endopeptidase has thus been considered a good model for structural and functional studies of the aspartic proteinases group, and of proteins in general. Water availability is a fundamental factor for protein stability and conformation flexibility, and these characteristics are imperative for proper functioning. The present approach intends to upgrade the understanding of aspartic proteases native conformation as a mutable form. Along the last few years, cardosin A structural conformation has been characterized in biphasic systems, aqueous solutions saturated by organic solvents, and more extensively in the presence of the organic solvent acetonitrile. In sequence with the work developed by our group, the unfolding of cardosin A was here induced by 2,2,2-trifluoroethanol (TFE), a polar and protic organic solvent with very different properties from the previous organic solvents tested. TFE characteristics promote distinct alterations in water structure, interacting in a particular way with the protein hydration layer and with the protein structure itself. Furthermore, it is known to stabilize well ordered conformations rather than inducing denaturation. The aim of the present work was to follow the conformational and functional alterations promoted by TFE proximity to cardosin A structure. The function dependence on enzyme structure was related to the availability of water and/or of hydrogen bonds to the protein surface. Different spectroscopic methods (circular dichroism and intrinsic fluorescence), activity measurements, and calorimetric analysis were employed to detect and characterize the organic solvent induced states. Finally, molecular dynamics/molecular mechanics (MD/MM) simulations were applied to the system in order to understand the interaction between protein and solvent molecules. The TFE in vitro assays with cardosin A promoted folding variations dependent of the alcohol concentration. TFE medium content below 4% decreased protein stability, but reversibly increased its enzymatic rate. TFE medium content over 20%. irreversibly inactivated the enzyme and unfolded its tertiary structure, while secondary helical content was progressively increased (mainly from previously unordered segments). At last, TFE medium content over 70% inactivated the enzyme and promoted a vast increase in structural complexity, taking form as characteristic open helical structures, and these alterations proved to be reversible. MD simulations with TFE and water described local alterations in protein flexibility, but no large conformational transformations. Instead, the model described an exposition of local competition of TFE with water for solvation surface. TFE molecules were found replacing several hydration molecules in the active site. Despite the catalytic water was not lost in the last acquired conformation of the high TFE content MD simulation, the active site was occupied by several TFE molecules, and this occurrence was proposed to justify the activity loss. The same reasoning can explain the activity recovery upon aqueous dilution, with the release of the active site for substrate binding.