Mind the gap : a new molecular model for the intracellular trafficking of connexin 43

Abstract

As gap junctions (GJ) são estruturas intercelulares multiméricas que permitem a comunicação directa entre células eucariotas, nomeadamente, a transferência de pequenos metabolitos, iões e mensageiros secundários. Para formar uma GJ, duas células adjacentes precisam de contribuir com um hemicanal, ou conexão, sendo este, por sua vez, composto por seis subunidades de uma proteína denominada conexina (Cx). A Cx43, um membro da família alfa das conexinas, pode ser encontrada em tecidos tão diversos como o coração, cristalino, retina, epiderme, cérebro, rim e medula óssea. A extensão da comunicação intercelular através de gap junctions (CIGJ) está directamente relacionada com o número e estado funcional dos canais presentes na membrana plasmática. Por isso, processos que influenciam a estabilidade de conexinas na membrana plasmática são críticos para regular a comunicação intercelular. Apesar da CIGJ poder ser regulada através da abertura e do fecho do poro do canal, a degradação de conexinas, particularmente da Cx43, desempenha um papel fundamental na regulação da CIGJ. De facto, e quando comparada com outras proteínas da membrana plasmática, a Cx43 tem um tempo de vida invulgarmente curto, de menos de 5 horas. Assim, é previsível que a desregulação da CIGJ tenha impacto em vários órgãos e tecidos. Por exemplo, no olho, o cristalino e o epitélio pigmentado da retina dependem da CIGJ para a manutenção da sua homeostase, e eventos que interfiram com a comunicação através de gap junctions poderão comprometer irreversivelmente a viabilidade destes tecidos ou ter importantes implicações funcionais. Nesta tese começamos por investigar os eventos moleculares que levam à disrupção da CIGJ em células epiteliais do cristalino. Procedemos depois com a investigação dos eventos moleculares que levam à internalização e degradação da conexina43, e que contribuem assim para a regulação da comunicação intercelular através de gap junctions. A comunicação intercelular no cristalino depende de uma extensa rede de gap junctions que são essenciais para a manutenção da transparência do cristalino. Como o cristalino está continuamente exposto a insultos oxidativos e as membranas plasmáticas do cristalino contêm a maior proporção de colesterol de qualquer membrana biológica, investigámos se a acumulação de produtos de oxidação do colesterol poderia interferir com a comunicação intercelular. Os resultados apresentados neste trabalho demonstram, pela primeira vez, que o oxisterol 7- ketocolesterol induz aumentos na CIGJ, que são muito provavelmente devidos a um aumento da estabilidade da proteína na membrana plasmática e a um consequente aumento na formação de placas de gap junctions. A sobreregulação da CIGJ no cristalino poderá afectar uma variedade de eventos altamente regulados, incluindo a diferenciação das células epiteliais do cristalino em fibras, o que, em último caso, poderá comprometer a transparência do cristalino levando ao desenvolvimento da catarata. A degradação da Cx43 como forma de regular a CIGJ, tem sido motivo de debate há mais de duas décadas, e tanto o proteassoma como o lisossoma já foram implicados neste mecanismo. Enquanto que a degradação da Cx43 pelo lisossoma está bem estabelecido, o papel do proteassoma no “turnover” da Cx43 é ainda pouco compreendido. No entanto, foi sugerido recentemente que o efeito da inibição do proteassoma na internalização de GJ está relacionado com a deplecção de ubiquitina livre, uma vez que está descrito que a conjugação da ubiquitina a uma variedade de proteínas membranares funciona como um sinal de endocitose. Alternativamente, o proteassoma poderá mediar a degradação de uma proteína ainda desconhecida, envolvida na regulação da estabilidade da Cx43 ao nível da membrana plasmática. Apesar de já ter sido demonstrado que a Cx43 é ubiquitinada, e que a fosforilação poderá servir como um sinal para a ubiquitinação da proteína, os mecanismos moleculares envolvidos na regulação da internalização e degradação da Cx43 continuam por esclarecer. Dados apresentados neste trabalho demonstram, pela primeira vez, que a ubiquitinação da Cx43 é mediada pela E3 ligase Nedd4 e que a conjugação de ubiquitina à Cx43 é necessária para a subsequente interacção com a proteína endocítica Eps15. De forma consistente, demonstramos ainda que a interacção entre os motivos de interacção com a ubiquitina da Eps15 e a forma ubiquitinada da Cx43 é necessário para que ocorra a internalização da Cx43. Demonstramos também que a ubiquitinação da Cx43 induz a internalização da proteína através de um mecanismo que é independente do motivo de endereçamento YXXØ, que medeia a internalização constitutiva da proteína por uma via dependente de clatrina. É provável que este mecanismo necessite da ubiquitinação de algumas, mas não de todas, as subunidades de um hemicanal. Ao passo que o papel da clatrina na internalização da Cx43 está bem estabelecido, os resultados apresentados neste estudo sugerem que, alternativamente, a Cx43 ubiquitinada poderá ser internalizada através de um mecanismo independente de clatrina. Está descrito que a ubiquitinação de algumas proteínas membranares também funciona como um sinal de endereçamento intracelular, que direcciona proteínas membranares para degradação no lisossoma. Neste estudo demonstramos que a ubiquitinação da Cx43 também pode sinalizar o seu tráfego intracelular para o lisossoma, através de um mecanismo que envolve a Hrs e a Tsg101, que são subunidades dos complexos ESCRT. Também foi demonstrado que a enzima de desubiquitinação UBPY poderá estar envolvida na modulação do tráfego intracelular da Cx43, promovendo o seu endereçamento para o lisossoma, onde é degradado. Por último, fornecemos provas de que a Cx43 internalizada pode ser reciclada de volta à membrana plasmática através de vias de reciclagem rápida e lenta, dependentes de Rab4 e Rab11 respectivamente, constituindo assim um novo nível de regulação para controlar a CIGJ. Apesar de caracterizarmos parcialmente as vias de internalização e de tráfego intracelular seguidas pela Cx43, muitas questões continuam por resolver, incluindo os mecanismos moleculares que determinam a via de internalização seguida pela Cx43 ubiquitinada bem como os mecanismos de interacção entre enzimas desubiquitinantes e proteínas Rab envolvidas no redireccionamento de Cx43 internalizada de volta à membrana plasmática. No entanto, este trabalho providencia uma base sólida para estudos futuros que tenham como objectivo uma melhor caracterização dos determinantes moleculares e mecanismos envolvidos na internalização e degradação da Cx43.

Gap junctions (GJ) are specialized cell–cell contacts that provide direct intercellular communication (IC) between eukaryotic cells, allowing for the transfer of small metabolites, ions and second messengers. Each of two adjacent cells contributes with one hemichannel to form a complete gap junction channel. Each hemichannel, or connexon is, in turn, composed by six subunits of a protein called connexin (Cx). Cx43, a member of the alpha connexin family, is the most widely expressed connexin protein, being found in tissues as diverse as the heart, lens, retina, skin, brain, kidney and bone marrow. The extent of gap junction intercellular communication (GJIC) is directly related to the number and functional state of gap junction channels present at the plasma membrane. Therefore, processes that influence the stability of connexins at the plasma membrane are critical for regulating intercellular communication. Although GJIC can be regulated through the gating of the channel pore, degradation of connexins, particularly Cx43, appears to play an unexpected and critical role in regulating GJIC. Indeed, Cx43 has a remarkably short half-life, of less than 5 hours, when compared to other plasma membrane proteins. Disruption of GJIC is likely to have an impact upon a variety of organs and tissues. For example, the eye lens and retinal pigmented epithelium rely on GJIC and disruption of communication through gap junctions is likely to have important functional implications. In this thesis we start by investigating the molecular events that lead to disruption of GJIC in lens epithelial cells. We further proceed by investigating the molecular events that lead to internalization and putative degradation of connexin43, and thus contribute to regulating intercellular communication through gap junctions. Intercellular communication in the eye lens relies on an extensive network of gap junctions essential for maintenance of lens transparency. Since the lens is continuously exposed to oxidative insult and lens plasma membranes contain the highest cholesterol content of any biological membrane we investigated whether accumulation of cholesterol oxidation products might interfere with intercellular communication. Results presented in this work show, for the first time, that the oxysterol 7-ketocholesterol induces an increase in GJIC, which is most likely due to an increased stability of the protein at the plasma membrane and to an increased abundance of Cx43 assembly into gap junction plaques. The upregulation of GJIC in the lens may disrupt a variety of highly regulated events, including differentiation of lens epithelial cells into fibres, which ultimately compromises lens transparency leading to the formation of cataract. Degradation of Cx43 as a means to regulate GJIC, has been a matter of debate for over the last two decades and both the proteasome and the lysosome have been implicated. Whereas degradation of Cx43 by the lysosome has long been established, the role of the proteasome in Cx43 turnover is poorly understood. However, recently it has been suggested that the proteasome may act by regulating the availability of free ubiquitin, as the conjugation of ubiquitin to a variety of plasma membrane proteins is known to function as an endocytic signal. Alternatively, the proteasome could mediate the degradation of a putative and still unknown protein involved in the regulation of Cx43 stability at the plasma membrane. Indeed, it has been shown that Cx43 is a substrate for ubiquitination and that treatments that promote Cx43 internalization, such as phosphorylation, also induce the ubiquitination of the protein. However, the molecular players and regulatory mechanisms involved in the internalization and degradation of Cx43 have remained elusive. Data presented in this work show, for the first time, that Cx43 ubiquitination is mediated by the E3 ligase Nedd4 and that the conjugation of ubiquitin to Cx43 is required for subsequent interaction with the endocytic protein Eps15. Consistently, we show that the interaction between the ubiquitin-interacting motif of Eps15 and the ubiquitinated form of Cx43 is required for Cx43 internalization. We have further shown that ubiquitination of Cx43 induces the internalization of the protein through a mechanism that is independent on the YXXØ sorting motif of Cx43, that mediates the constitutive internalization of the protein. This mechanism is likely to require the ubiquitination of some, but not all, subunits of one hemichannel. While the role of clathrin in Cx43 internalization has been well established, the results presented in this study suggest that ubiquitinated Cx43 can also be internalized through a clathrin-independent mechanism. Ubiquitination of some integral membrane proteins is also known to function as an intracellular sorting signal, which directs membrane proteins for degradation in the lysosome. In this study we show that ubiquitination of Cx43 can also act as a signal for its intracellular sorting to the endolysosomal compartment, through a mechanism involving the ESCRT machinery components Hrs and Tsg101. The deubiquitinating enzyme UBPY was also shown to modulate the intracellular trafficking of Cx43, by promoting its intracellular sorting to the lysosome for degradation. Finally, we provide evidence that internalized Cx43 can be recycled back to the plasma membrane through both a rapid and a slow recycling pathway, thus adding a new level of regulation to control GJIC. Although we partially characterize the internalization and intracellular trafficking routes followed by Cx43, many questions remain unresolved, these include the molecular mechanisms that determine the internalization pathway followed by ubiquitinated Cx43 as well as the interplay between deubiquitinating enzymes and Rab proteins in redirecting internalized Cx43 back to the plasma membrane. Nevertheless, this study provides a solid basis for future research aiming at further characterizing the molecular players and mechanisms involved in Cx43 internalization and degradation.