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Title: O envolvimento de mediadores inflamatórios na disfunção microvascular da retina: implicações para a ruptura da barreira hemato-retiniana na retinopatia diabética
Authors: Aveleira, Célia Alexandra Ferreira de Oliveira 
Issue Date: 21-Jan-2010
Citation: Aveleira, Célia Alexandra Ferreira de Oliveira - O envolvimento de mediadores inflamatórios na disfunção microvascular da retina: implicações para a ruptura da barreira hemato-retiniana na retinopatia diabética. Coimbra, 2010
Abstract: A retinopatia diabética é uma das complicações mais comuns da diabetes mellitus, e uma das principais causas de perda de visão e cegueira em adultos em idade activa nos países desenvolvidos. A ruptura da barreira hemato-retiniana (BHR) é a principal característica desta doença, sendo uma das alterações mais precoces que ocorrem na retina de doentes diabéticos. Evidências recentes sugerem que processos inflamatórios crónicos desempenham um papel importante na patogénese da retinopatia diabética. Os níveis de citocinas como a interleucina-1β (IL-1β) e o factor de necrose tumoral-α (TNF-α) estão aumentados no vítreo de doentes diabéticos e nas retinas de animais diabéticos, e estes aumentos correlacionam-se com um aumento da permeabilidade da BHR. No entanto, os mecanismos moleculares envolvidos na disfunção endotelial e alteração da permeabilidade da vasculatura da retina induzidas por estas citocinas não estão esclarecidos. Assim, este estudo teve como principal objectivo avaliar o efeito da IL-1β e do TNF-α na permeabilidade de células endoteliais dos vasos da retina, prestando particular atenção aos mecanismos moleculares subjacentes ao aumento da permeabilidade celular induzida pelo TNF-α. Além disso, avaliou-se também o efeito da glucose elevada e da IL-1β na regulação do receptor da IL-1 tipo I (IL-1RI). As citocinas IL-1β e TNF-α induziram um aumento da permeabilidade das células endoteliais da retina de bovino (BREC), dependente da concentração e do tempo de exposição, sendo o TNF-α mais eficaz. O TNF-α induziu uma diminuição, a nível proteico e de RNA mensageiro, da zonula occludens -1 (ZO-1) e claudina-5. Contrariamente, a expressão de ocludina aumentou significativamente. Além disso, a localização celular destas proteínas alterou-se após exposição a TNF-α. Devido à natureza inflamatória da retinopatia diabética, avaliou-se o possível efeito protector do glucocorticóide dexametasona na permeabilidade celular induzida por TNF-α. A dexametasona preveniu completamente as alterações nas junções oclusivas e o aumento da permeabilidade celular induzido por TNF-α. O efeito protector da dexametasona foi dependente da transactivação do receptor dos glucocorticóides, uma vez que o antagonista deste receptor, RU486, reduziu o seu efeito protector. Porém, o efeito do RU486 foi apenas parcial, sugerindo que outros mecanismos estão envolvidos. O factor de transcrição nuclear κB (NF-κB) constitui um alvo central na via de sinalização do TNF-α, e foi demonstrado que a sua activação pode ser inibida pelo tratamento com glucocorticóides. A inibição da activação do NF-κB, através da inibição da cinase da proteína inibitória do NF-κB (IKK) e da sobre-expressão da proteína inibitória do NF-κB α (IκBα) mediada por adenovírus, preveniu, parcialmente, o aumento da permeabilidade induzida por TNF-α, sugerindo um novo papel do NF-κB na regulação da permeabilidade vascular. Mais ainda, a inibição da proteína cinase C ζ (PKCζ) reduziu a activação do NF-κB e preveniu completamente o efeito do TNF-α nas proteínas das junções oclusivas, bem como o aumento da permeabilidade em células endoteliais da retina e também dos vasos da retina de rato induzido por TNF-α. Este conjunto de observações mostra que o TNF-α altera a estrutura das junções oclusivas e aumenta a permeabilidade das células endoteliais de retina. Mais ainda, a inibição da PKCζ previne completamente o aumento de permeabilidade induzida por TNF-α, em parte, pela redução da activação do NF-κB. Estes resultados sugerem que a PKCζ pode ser considerada como um novo alvo terapêutico para a prevenção da permeabilidade vascular induzida por citocinas. Apesar das células endoteliais da retina constituírem um alvo preferencial da IL-1β e TNF-α, pouco se sabe sobre a regulação dos seus respectivos receptores, como por exemplo o IL-1RI, neste tipo de células. Como a actividade biológica da IL-1β é mediada principalmente pelo IL- 1RI, avaliou-se o efeito da glucose elevada e da IL-1β na regulação da expressão do IL-1RI numa linha celular de células endoteliais da retina de rato (TR-iBRB2). A exposição das células endoteliais a glicose elevada, manitol (controlo osmótico) ou IL-1β, durante períodos relativamente curtos (1-24 h), causou uma diminuição significativa, dependente do tempo de exposição, do receptor IL-1RI. A exposição longa (7 dias) a glicose elevada ou manitol causou também uma diminuição significativa do receptor nas células endoteliais da retina. A diminuição dos níveis proteicos de IL-1RI foi inibida pela presença de anticorpos contra IL-1β e IL-1RI, sugerindo que a activação do IL-1RI pela IL-1β é um evento necessário neste processo. A diminuição do IL-1RI induzida pela glucose elevada ou IL-1β foi prevenida por inibidores do lisossoma, mas não por inibidores do proteossoma. Além disso, observou-se também que o receptor da IL-1β transloca-se para o núcleo, onde se acumula, após a exposição a glucose elevada ou IL-1β. Os resultados obtidos mostram que a glicose elevada, provavelmente devido ao stress osmótico, e a IL-1β regulam o conteúdo do IL-1RI nas células endoteliais da retina. A diminuição de IL-1RI é induzida pela sua activação e depende, em parte, da sua degradação através do lisossoma e da sua translocação e acumulação no núcleo. Uma vez que a regulação do IL-1RI tem consequências importantes na via de sinalização da IL-1β, o IL-1RI pode ser considerado um possível alvo terapêutico para a tratamento da retinopatia diabética. Em conclusão, os resultados apresentados neste estudo oferecem uma nova perspectiva sobre o efeito de citocinas na regulação da permeabilidade celular das células endoteliais de retina. Além disso, os receptores de citocinas ou alvos específicos a jusante, tais como a PKCζ, podem ser considerados como potenciais novos alvos terapêuticos para o tratamento da permeabilidade vascular em doenças oculares caracterizadas por níveis elevados de citocinas, tais como a retinopatia diabética.
Diabetic retinopathy is one of the most common complications of diabetes mellitus and remains a leading cause of vision loss and blindness in working-age adults in developed countries. Retinal microvascular dysfunction is an early feature of diabetic retinopathy, and the bloodretinal barrier (BRB) breakdown is the hallmark of the disease. Growing evidence indicates that low-grade and chronic inflammatory processes play an important role in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Elevated levels of the cytokines interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in the vitreous of diabetic patients and in diabetic rat retinas correlate with increased retinal vascular permeability. However, the mechanisms by which cytokines induce endothelial cell dysfunction and alter retinal vascular permeability remain unclear. Therefore, the main goal of the present study was to investigate the effect of IL-1β and TNF-α on retinal endothelial cell permeability, giving particular attention to the molecular mechanisms underlying the increase in cell permeability induced by the more potent permeabilizing factor, TNF-α. Additionally, the regulation of the interleukin-1 type I receptor (IL-1RI) content in retinal endothelial cells exposed to elevated glucose or IL-1β was also investigated. Both IL-1β and TNF-α increased bovine retinal endothelial cell (BREC) permeability in a concentration- and time-dependent manner, being TNF-α more effective. TNF-α induced a marked downregulation of zonula occludens-1 (ZO-1) and claudin-5 protein content, concomitant with a decrease in the respective transcripts expression. Conversely, TNF-α increased occludin expression. In addition, the junctional localization of these tight junction proteins was altered by TNF-α. Given the inflammatory nature of diabetic retinopathy, the ability of the glucocorticoid dexamethasone to prevent TNF-α-induced cell permeability was evaluated. Dexamethasone completely prevented the disruption of the tight junction complex and the increase in cell permeability induced by TNF-α. Moreover, the protective effect of dexamethasone was dependent on transcriptional activation of the glucocorticoid receptor, since RU486, a glucocorticoid receptor antagonist, reduced the protective effect of dexamethasone on TNF-α- induced cell permeability. However, RU486 effect was only partial, suggesting that additional mechanisms are involved. The transcription factor nuclear factor-κB (NF-κB) is a critical target of the TNF-α signaling pathway, and its activation can be inhibited by glucocorticoid treatment. Preventing NF-κBactivation with a chemical inhibitor of the inhibitor NF-κB protein kinase (IKK) or with adenovirus-mediated overexpression of the inhibitor NF-κB protein α (IκBα) partially prevented the increase in cell permeability induced by TNF-α, implying a new role for NF-κB in cell permeability regulation. Furthermore, protein kinase C ζ (PKCζ) inhibition reduced NF-κB activation and completely prevented the alterations in the tight junction complex and cell permeability induced by TNF-α, both in cell cultures and in the retinal vasculature of rats. Taken together, these results demonstrate that TNF-α alters the tight junction complex and increases retinal endothelial cell permeability. Further, inhibition of PKCζ completely prevents TNF-α-induced cell permeability, in part, by reducing NF-κB activation. These results suggest that PKCζ may be considered as a specific therapeutic target for the prevention of cytokineinduced vascular permeability. Although retinal endothelial cells are primarily affected by IL-1β and TNF-α, little attention has been given to the regulation of their cognate receptors, such as IL-1RI, in these cells. As IL-1β activity is regulated primarily by IL-1RI, the effect of high glucose and IL-1β on IL-1RI regulation was also investigated in a rat retinal capillary endothelial cell line (TR-iBRB2). A time-dependent downregulation of IL-1RI occurred in cells exposed to high glucose, mannitol (osmotic control) or IL-1β (1-24 h). Long-term exposure (7 days) of retinal endothelial cells to high glucose or mannitol also decreased IL-1RI protein content. The downregulation of IL-1RI was completely prevented by anti-IL-1RI or anti-IL-1β antibodies, indicating that IL-1RI activation by IL-1β is a necessary event in this process. IL-1RI downregulation was prevented by lysosome inhibitors but not by proteasome inhibitors. It was also found that IL-1RI translocates to the nucleus after high glucose, mannitol or IL-1β treatment. These results indicate that high glucose, probably due to osmotic stress, and IL-1β downregulate IL-1RI in retinal endothelial cells. The downregulation of IL-1RI is triggered by its activation and is due, at least partially, to lysosomal degradation and translocation and accumulation in the nucleus. Given the potential important role of IL-1β on the pathogenesis of diabetic retinopathy, the inhibition of IL-1β action by targeting IL-1RI may be considered another potential therapeutic strategy for the treatment of diabetic retinopathy. In summary, the results presented herein provide new insight into the role of pro-inflammatory cytokines on retinal endothelial cell barrier function. Moreover, cytokine receptors or specific downstream targets, such as PKCζ, may be considered potential novel therapeutic targets for the treatment of vascular permeability in ocular diseases characterized by elevated levels of cytokines, such as diabetic retinopathy.
Description: Tese de doutoramento em Ciências Biomédicas apresentada à Fac. de Medicina da Univ. de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/12268
Rights: embargoedAccess
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