Transformação genética de Anthurium schherzerianum por RNA antisense

Abstract

Anthurium scherzerianum Schott. é uma Monocotiledónea da família Araceae que possui inflorescências de longa duração e constitui uma das espécies mais populares e importantes a serem vendidas como plantas envasadas. A produção de novas cultivares é difícil devido ao elevado grau de incompatibilidade genética entre as diferentes variedades. O objectivo deste trabalho consiste no estabelecimento das bases para a transformação genética de A. scherzerianum, de molde a serem produzidas novas variedades com colorações únicas para introdução no mercado da floricultura. A regeneração de plantas foi obtida a partir de calos formados em secções de limbos, pecíolos e entrenós. Foi utilizado um único meio de cultura para todas as experiências in vitro, consistindo numa modificação do meio MS, suplementado com 1 mg/l BA, 0.1 mg/l NAA e 3% sacarose. Neste meio desenvolveram-se, esporadicamente e principalmente após stress de nutrientes, embriões somáticos por embriogénese directa ou indirecta, com origem em células da camada subepidérmica. Isolou-se o RNA total de espatas vermelhas desta espécie por extracção com fenol. No Northern blotting foi usada uma sonda heteróloga (cDNA da chalcona sintetase (CHS) de Petunia hybrida), surgindo uma banda correspondente à CHS cujo sinal era mais intenso em espatas jovens. Desenharam--se primers degenerados pelo alinhamento de sequências para CHS doutras espécies mas não foi obtida qualquer banda correspondente ao cDNA de CHS. Todavia, obtiveram-se dois fragmentos de outra enzima da via biossintética das antocianinas, a dihidroflavonol 4-redutase (DFR). Estes denominaram--se DFR663 e DFR676 possuindo 759 e 704 pb, ambos compreendendo a extremidade 3’ do cDNA completo. A diferença nos seus tamanhos é devida principalmente à região 3’-UTR. O alinhamento das sequências de DFR663 e DFR676 com outras espécies revelou uma homologia superior a 50%. Realizaram-se experiências de resistência de explantes de A. scherzerianum a dois antibióticos da família dos aminoglicósidos. Os explantes mostraram resistência a 250 mg/l de canamicina mas a geneticina a 25 mg/l induziu necrose em todos após 15 semanas. As experiências para a transferência mediada por Agrobacterium ou por biolística não foram conclusivas. Foi realizada a clonagem de DFR663 e CHS, em orientação sense ou antisense, num vector para transformação por Agrobacterium.