Design and development of gemcitabine-loaded nanoplatforms for advanced pancreatic cancer-targeted therapies

Abstract

Pancreatic cancer (PC) is currently one of the most challenging human malignancies worldwide with its incidence and mortality projected to rise in the next years. The lack of early diagnosis, together with poor prognosis, high rate of tumor relapse and pathological complexity vastly undermine its therapy success and patient survival. Although treatment options include mainly surgery in localized staged PC, together with chemotherapy, in most cases PC is detected at advanced stage and tumor resection is not available; and chemotherapy faces serious challenges on account of lack of effectiveness, severe systemic toxicity, lack of specificity, stability and tumor biodistribution, accelerated clearance and to the emergence of multidrug resistant phenotype in PC cells. Micelles consist of versatile size-tunable core-shell nanoparticles with a hydrophobic core and water-soluble shell widely employed for improved solubilization, stability and pharmacokinetic profile of poorly water-soluble drugs. Additionally, they are highly tunable colloidal systems enabling preferential accumulation in tumors by enhanced permeability and retention (EPR) effect, thus improving PC targeting and drug biodistribution, and reducing off-target systemic toxicity. Micelles are generally prepared by self-assembly of amphiphilic polymers of biocompatible features, some of them including additional and attractive bioactive activities, namely anticancer, multidrug resistance reversal and antioxidant properties. Vitamin E (VE)-based building blocks display relevant features as tailor-made structural units to build hydrophobic prodrug conjugate systems and also posing as suitable micellar drug delivery systems, showing enhanced biocompatibility, FDA-approval status and anticancer activity, such as VE succinate (VES) and D-α-tocopheryl polyethylene glycol (PEG) 1000 succinate (TPGS). Recently, cell membrane-coated nanosystems have been described to prolong blood circulation of nanoparticle cores, avoid immune clearance and provide selective targeting features in in vivo models of disease, including in PC. Cancer cell membrane-coated nanoparticle cores display additional tumor targeting attributes by a homotypic mechanism, and expose relevant surface markers to engage in immunomodulation strategies. In this Thesis, antimetabolite gemcitabine (GEM) was selected as cytotoxic agent widely used in PC therapy, and further conjugated with hydrophobic anticancer agent VES to assemble VES-GEM conjugate and enable further encapsulation in micelles and achieving GEM micellar nanoformulation. The VES-GEM conjugate was encapsulated in micelles composed of FDA-approved, biocompatible and biofunctional polymers, namely triblock copolymers poly (ethylene oxide) poly (propylene oxide)-poly (ethylene oxide) (Pluronic® F68 and Pluronic® F127), graft copolymer polyvinyl caprolactam-polyvinyl acetate-polyethylene glycol (Soluplus®), and VE-based PEGylated polymer TPGS. The formulations were prepared with green methodology and characterized regarding morphology, size, surface charge, polydispersity index, drug release profile, stability, purification methods, haemolytic activity, in vitro cytotoxicity and cellular internalization. Furthermore, selected VES-GEM loaded TPGS and Soluplus® micelles were explored as templates for coating with PC cell membranes extracted from BxPC3 cell line and the systems were analysed regarding their size, surface charge, polydispersity index, morphology and co-localization. The results presented in this Thesis demonstrate that VES-GEM-loaded micelles comprise adequate systems for GEM delivery to PC achieving high GEM encapsulation and drug loading, enhanced GEM stability, notorious controlled release profile for long-lasting anticancer activity, strong cytotoxic activity in PC cell line and considerable cellular internalization. The modification with PC cell membranes yielded strongly negatively-charged hybrid systems potentially mimicking – even if partially – the surface of native PC cells and exhibit promise towards development of biomimetic hybrid micelle-based systems for cutting-edge innovative PC therapies.

O cancro do pâncreas (CP) é atualmente uma das neoplasias humanas mais difíceis de tratar em todo o mundo, prevendo-se que a sua incidência e mortalidade aumentem nos próximos anos. A falta de diagnóstico precoce, juntamente com o mau prognóstico, a elevada taxa de recidiva do tumor e a complexidade patológica, prejudicam grandemente o sucesso da sua terapia e a sobrevivência dos doentes. Embora as opções de tratamento incluam principalmente a cirurgia no CP em estadio localizado, juntamente com a quimioterapia, na maioria dos casos o CP é detetado em fase avançada e a ressecção do tumor não é possível; e a quimioterapia enfrenta sérios desafios devido à falta de eficácia, à presença de toxicidade sistémica grave, bem como à falta de especificidade, estabilidade e biodistribuição tumoral e eliminação acelerada, aliada ao aparecimento de um fenótipo multirresistente. As micelas são nanopartículas versáteis de tamanho ajustável, com um núcleo hidrofóbico e uma periferia solúvel em água, amplamente utilizadas para melhorar a solubilização, a estabilidade e o perfil farmacocinético de fármacos pouco solúveis em água. Além disso, são sistemas coloidais altamente sintonizáveis que permitem a acumulação preferencial em tumores através de um efeito de permeabilidade e retenção (EPR), melhorando assim o direcionamento para o CP e a biodistribuição dos fármacos e reduzindo a toxicidade sistémica. Estes sistemas são geralmente preparados por auto-montagem de polímeros anfifílicos com características biocompatíveis, alguns dos quais incluem atividades bioactivas atrativas adicionais, nomeadamente propriedades anticancerígenas e de reversão da resistência a múltiplos fármacos, bem como propriedades antioxidantes. As unidades estruturais à base de vitamina E (VE) apresentam características relevantes para a preparação de sistemas hidrofóbicos de pró-fármacos e também como sistemas micelares adequados para administração de fármacos, e evidenciam uma maior biocompatibilidade, estatuto de aprovação pela FDA e atividade anticancerígena, como é o caso do succinato de VE (VES) e o succinato de D-α-tocoferil polietilenoglicol (PEG) 1000 (TPGS). Recentemente, foi reportado que o revestimento de nanopartículas por membranas celulares é passível de prolongar a circulação sanguínea da nanopartícula encapsulada, evitar a depuração pelo sistema imunitário e proporciona características seletivas de direcionamento em modelos in vivo de doenças, incluindo no CP. As nanopartículas revestidas com membranas oriundas de células cancerígenas apresentam atributos adicionais de direcionamento para o tumor através de um mecanismo homotípico e expõem marcadores de superfície relevantes para participar em estratégias de imunomodulação. Nesta tese, o fármaco antimetabolito gemcitabina (GEM), amplamente utilizado na terapia de CP na forma de solução injetável sob o nome comercial Gemzar®, foi selecionado como agente citotóxico e posteriormente conjugado com o agente anticancerígeno hidrofóbico VES para obter o conjugado VES-GEM e maximizar a encapsulação da GEM em micelas e obter uma nanoformulação micelar de GEM. O conjugado VES-GEM foi encapsulado em micelas compostas por polímeros biocompatíveis e biofuncionais aprovados pela FDA, nomeadamente copolímeros tribloco poli(óxido de etileno) poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno) (Pluronic® F68 e Pluronic® F127), copolímero ramificado polivinil caprolactamo-polivinil acetato-polietilenoglicol (Soluplus®) e polímero PEGilado TPGS à base de VE. As formulações foram preparadas com recurso a uma tecnologia green e caracterizadas quanto à morfologia, tamanho, carga de superfície, índice de polidispersão, perfil de libertação do fármaco, estabilidade, métodos de purificação, atividade hemolítica, citotoxicidade e internalização celular. Além disso, as micelas de TPGS e Soluplus® carregadas com VES-GEM foram exploradas como modelos para revestimento com membranas celulares de PC extraídas da linha celular BxPC3, e os sistemas foram analisados quanto ao seu tamanho, carga superficial, índice de polidispersão, morfologia e co-localização. Os resultados apresentados nesta tese permitiram demonstrar que as micelas carregadas com VES-GEM constituem sistemas adequados para a administração de GEM num contexto de CP, alcançando uma elevada encapsulação de GEM e carga de fármaco, juntamente com maior estabilidade da GEM, notório perfil de libertação controlada para uma atividade anticancerígena de longa duração, significativa atividade citotóxica em linha celular e CP e considerável internalização celular. A modificação das micelas usando membrana celular proveniente de CP possibilitou a obtenção de sistemas híbridos fortemente carregados negativamente, com potencial habilidade de mimetização – mesmo que parcialmente – no que toca à superfície de células de CP, revelando-se promissores para o desenvolvimento de sistemas híbridos biomiméticos baseados em micelas para terapias inovadoras de ponta para o CP.