Radioterapia e Inibidor da PARP: Combinação Terapêutica para o Cancro do Pâncreas

Abstract

Pancreatic cancer is among the cancers with the highest mortality rate worldwide, with the number of new cases almost equal to the number of deaths. This is attributable to its asymptomatic progression and aggressive nature, which combined with late diagnosis and ineffective therapeutic options, results in a very low 5-year survival rate. Current therapeutic options for this disease include surgery, chemotherapy, and radiotherapy. However, the only potentially curative approach is surgical intervention, if the tumor is resectable, which is feasible only for a small percentage of patients. Therefore, discovering new and effective therapeutic strategies for pancreatic cancer is essential. Radiotherapy is one of the most widely employed cancer treatments, which involves the use of ionizing radiation targeted at the tumor site to eradicate cancer cells by inducing single-strand breaks (SSBs) and double-strand breaks (DSBs) in DNA. Poly (adenosine diphosphate-ribose) polymerase inhibitors (PARPi) have been studied as a therapeutic strategy for cancer and act by inhibiting PARP, resulting in the absence of SSBs repair that can be converted into DSBs. Thus, the combination of these therapies will result in an accumulation of DNA lesions, leading to the death of cancer cells. Therefore, the main objective of this dissertation was to evaluate the therapeutic potential of combining radiotherapy with the iPARP olaparib in two pancreatic cancer cell lines (PANC-1 and Hs 766T). Firstly, the doubling time of the two cell lines was calculated for a better understanding of the cell lines and establishment of experimental conditions, showing that the PANC-1 cell line proliferates faster than the Hs 766T cell line. Next, cell survival was assessed after exposure to the treatments of radiotherapy in monotherapy, olaparib in monotherapy, and the simultaneous combination of 1 µM olaparib with increasing doses of X-rays. For conditions including the treatment with olaparib, two approaches were tested: olaparib remaining throughout the incubation period and its removal 72 hours after administration. The obtained SER values showed that olaparib radiosensitized the cells of both cell lines, allowing for a reduction in radiation dose when compared to radiotherapy alone, with better efficacy achieved when olaparib remained in contact with the cells throughout all the incubation period. In a second phase, the effects of monotherapy and combination treatments at the DNA level were evaluated. To achieve this goal, the genotoxicity of the treatments with 1 µM olaparib and 2 Gy of X-ray radiation in monotherapy and in combination was assessed, showing that the combined treatment had a greater capacity to induce DNA lesions than the individual treatments in both cell lines. These results were further validated by detecting the presence of DSBs through the quantification of γ-H2AX foci by immunofluorescence, revealing that the combined treatment caused a higher amount of DSBs in the PANC-1 cell line compared to the individual treatments. However, no differences were detected between the control and treatment conditions in the Hs 766T cell line. In conclusion, the obtained results indicate that olaparib radiosensitizes pancreatic cancer cells to X-rays, with the combined treatment being more effective than the individual treatments.

O cancro do pâncreas é um dos tipos de cancro com maior taxa de mortalidade a nível mundial, apresentando um número de novos casos quase igual ao número de mortes. Tal deve-se à sua progressão assintomática e natureza agressiva que, aliado a diagnósticos tardios e a opções terapêuticas ineficazes, culmina numa taxa de sobrevivência a 5 anos muito baixa. As atuais opções terapêuticas para esta doença incluem a cirurgia, a quimioterapia e a radioterapia. No entanto, a única abordagem potencialmente curativa é a intervenção cirúrgica, quando o tumor é ressecável, opção que só viável para uma pequena percentagem de doentes. Desta maneira, é fundamental a descoberta de novas e eficazes abordagens terapêuticas para o cancro do pâncreas. A radioterapia é um dos tipos de tratamento do cancro mais utilizados, e envolve o uso de radiação ionizante direcionada ao local do tumor para erradicar as células tumorais, induzindo quebras de cadeia simples (SSBs, do inglês single-strand breaks) e quebras de cadeia dupla (DSBs, do inglês double-strand breaks) no DNA. Os inibidores da poli (adenosina difosfato-ribose) polimerase (iPARP) têm sido estudados como uma estratégia terapêutica para o cancro e atuam inibindo a PARP, que resulta na ausência de reparação de SSBs que se poderão converter em DSBs. Assim, a combinação destas terapias resultará numa sobrecarga de lesões no DNA, com consequente morte das células tumorais. Desta maneira, o principal objetivo desta dissertação foi avaliar o potencial terapêutico da combinação de radioterapia com o iPARP olaparib em duas linhas celulares de cancro do pâncreas (PANC-1 e Hs 766T). Primeiramente foi calculado o tempo de duplicação das duas linhas celulares para um melhor conhecimento das mesmas e estabelecimento das condições experimentais, tendo-se constatado que a linha celular PANC-1 prolifera mais rápido que a linha celular Hs 766T. De seguida foi avaliada a sobrevivência celular após a exposição das células aos tratamentos de radioterapia em monoterapia, olaparib em monoterapia e combinação simultânea de 1 µM de olaparib com doses crescentes de raios-X. Nas condições que incluem tratamento com olaparib foram testadas duas abordagens: a permanência do olaparib durante todo o tempo de incubação e a sua remoção 72h após a sua administração. Os valores de SER obtidos comprovaram que o olaparib radiossensibilizou as células de ambas as linhas celulares, permitindo uma redução de dose de radiação quando comparada com a radioterapia isolada, tendo sido obtida uma melhor eficácia com a estratégia de permanência do olaparib em contacto com as células durante todo o tempo de incubação. Numa segunda fase, avaliaram-se os efeitos dos tratamentos em monoterapia e em combinação a nível do DNA. Para isso, avaliou-se a genotoxicidade dos tratamentos com 1 µM de olaparib e 2 Gy de radiação-X em monoterapia e em combinação, onde se verificou que o tratamento combinado apresentou uma maior capacidade de induzir lesões no DNA, que os tratamentos isolados, em ambas as linhas celulares. Estes resultados foram ainda validados pela deteção da presença de DSBs através da quantificação de foci -H2AX por imunofluorescência, constatando-se que o tratamento combinado induziu uma maior quantidade de DSBs na linha celular PANC-1 que os tratamentos isolados, contudo na linha celular Hs 766T não foram detetadas diferenças entre as condições de controlo e de tratamento.Concluindo, os resultados indicam que o olaparib radiossensibiliza as células de cancro do pâncreas aos raios-X, tendo o tratamento combinado uma melhor eficácia que os tratamentos isolados.