Molecular Mechanisms of Presynaptic APP Function in the Context of Alzheimer's Disease

Abstract

Alzheimer's disease (AD) is characterized by memory loss, behavioural changes, and the inability to perform daily tasks, affecting millions of people worldwide. AD pathogenesis is marked by neurofibrillary tangles (NFT) of hyperphosphorylated tau protein and extracellular amyloid-β (Aβ) plaques, which result from the accumulation of Aβ peptides arising from the cleavage of the transmembrane amyloid precursor protein (APP). There are sporadic and familial forms of AD. Familial early-onset AD, which represents a small fraction of cases, is caused by mutations in the Presenilin (PS) 1, PS2, or APP genes. Synaptic dysfunction correlates with cognitive decline, and accumulating evidence suggests that AD patients exhibit impairments of presynaptic mechanisms. This includes deficits in plasticity mechanisms, altering the excitatory/inhibitory synaptic balance, and subsequently impacting neuronal circuits. APP is a transmembrane protein expressed in neurons and synaptic compartments, undergoing proteolytic processing to generate various cleavage products, including Aβ. APP and the related APP-like protein APLP2 constitute nearly 1% of the total proteins in presynaptic compartments and interact with presynaptic proteins involved in vesicular release processes, suggesting a crucial role in regulating neurotransmitter release and presynaptic plasticity. APP is present in mossy fibre (MF) synapses, which connect dentate gyrus (DG) cells to Cornu Ammonis (CA) 3 pyramidal cells. Given that the hippocampal CA3 subregion is essential for associative memory formation and recall, impairments in neurotransmitter release and loss of synaptic function in this region likely contribute to cognitive decline. The host laboratory recently showed that deleting presynaptic APP at MF-CA3 synapses results in presynaptic deficits, which may induce deficits in memory encoding. In this project, we aimed to understand the molecular mechanisms by which APP participates in presynaptic plasticity at MF synapses. To this end, we resourced to an APP/APLP2 conditional double KO mice, which allows the deletion of APP (and APLP2) at MF-CA3 synapses based on Cre-Lox recombination technology combined with viral tools targeting the DG. We purified MF synaptosomes and sent the samples for proteomic analysis. From the mass spectrometry analysis, we selected four dysregulated targets in the APP/APLP2 conditional dKO animals: ZnT3, CSPα, CPLX1 and CPLX2. To validate these findings, I performed a series of immunohistochemical protocols combined with epifluorescence, confocal, and stimulated emission depletion (STED) microscopy, as well as capillary western blots and immunocytochemistry. The validation of these three targets as proteins dysregulated in the absence of APP sheds light on the presynaptic deficits observed in the APP/APLP2 conditional dKO.

A doença de Alzheimer (DA) é caracterizada por perda de memória, alterações comportamentais e incapacidade de realizar tarefas diárias, afectando milhões de pessoas. A patogénese da DA é marcada por emaranhados neurofibrilares de proteína tau hiperfosforilada e placas extracelulares de amiloide-β (Aβ), que se formam a partir da acumulação de péptidos Aβ resultantes da clivagem da proteína precursora amiloide transmembranar (APP). Existem formas esporádicas e familiares de DA. A DA familiar de início precoce, que representa uma pequena fração dos casos, é causada por mutações nos genes Presenilina (PS) 1, PS2 ou APP. A disfunção sináptica está correlacionada com o declínio cognitivo, e a evidência acumulada sugere que os doentes com DA apresentam deficiências nos mecanismos pré-sinápticos. Isto inclui défices nos mecanismos de plasticidade, alterando o equilíbrio sináptico excitatório/inibitório e, subsequentemente, afectando os circuitos neuronais. A APP é uma proteína transmembranar expressa nos neurónios e nos compartimentos sinápticos, que passa por um processamento proteolítico para gerar vários produtos de clivagem, incluindo a Aβ. A APP e a proteína da mesma família APLP2 constituem cerca de 1% do total de proteínas dos compartimentos pré-sinápticos e interagem com proteínas pré-sinápticas envolvidas nos processos de libertação vesicular, o que sugere um papel crucial na regulação da libertação de neurotransmissores e da plasticidade pré-sináptica. A APP está presente nas sinapses de mossy fiber (MF), que ligam as células do giro dentado (DG) às células piramidais do Cornu Ammonis (CA) 3. Dado que a sub-região CA3 do hipocampo é essencial para a formação e recordação da memória associativa, as deficiências na libertação de neurotransmissores e a perda da função sináptica nesta região contribuem provavelmente para o declínio cognitivo. No laboratório foi mostrado recentemente que a eliminação da APP pré-sináptica nas sinapses MF-CA3 resulta em défices pré-sinápticos, que podem induzir défices na codificação da memória. Neste projeto, pretendemos compreender os mecanismos moleculares pelos quais a APP participa na plasticidade pré-sináptica nas sinapses MF. O modelo animal utilizado, murganhos com duplo KO condicional APP/APLP2, permite a deleção da APP (e APLP2) nas sinapses MF-CA3 com base na tecnologia de recombinação Cre-Lox combinada com ferramentas virais dirigidas à DG. Purificámos os sinaptossomas de MF e enviámos as amostras para análise proteómica. A partir da análise de espetrometria de massa, identificámos três alvos desregulados nos animais dKO condicionais APP/APLP2: ZnT3, CSPα, CPLX1 e CPLX2. Para validar estes resultados, efectuei uma série de protocolos imunohistoquímicos combinados com microscopia de epifluorescência, confocal e depleção de emissão estimulada (STED), bem como western blots capilares e imunocitoquímica. A validação destes quatro alvos como proteínas desreguladas na ausência de APP lança luz sobre os défices pré-sinápticos observados no dKO condicional APP/APLP2.