Improving the accuracy of permeability data to gain predictive power: assessing sources of variability in assays using cell monolayers

Abstract

The ability to predict the rate of permeation of new chemical entities across biological membranes is of high importance for their success as drugs, as it determines their potential efficacy, pharmacokinetics and safety profile. In vitro permeability assays, particularly using the Caco-2 cell line, are commonly used to predict the permeability of compounds across the intestinal epithelium and oral absorption in humans. There is an extensive amount of Papp values generated from these assays available in literature and a significant fraction is collected in databases. The compilation of these Papp values for large datasets allows the application of artificial intelligence tools for establishing quantitative structure-permeability relationships (QSPRs) to predict the permeability of compounds from their structural properties. One of the main challenges that hinders the development of accurate predictions is the existence of multiple Papp values for the same compound, caused by differences in the experimental protocols employed. The present work aims to contribute to increase the throughput of this important assay and to decrease the variability in Papp data, the later by quantitatively characterizing the effect on Papp values for common experimental alterations in the protocols. The reference protocol involves seeding Caco-2 cells on permeable membranes for at least 21 days to establish a cohesive monolayer of differentiate cells, which is used in a single permeability assay between days 21 and 30. In this work, a methodology was developed to allow the re-use of Caco-2 monolayers in at least two additional permeability assays, and implemented for assays on days 22, 25 and 28. The proposed re-use protocol was validated regarding i) maintenance of cohesion and integrity of the cell monolayer (using TEER measurements, permeability assays with paracellular markers and microscopic visualization of morphology and tight junctions staining after labeling with fluorescent antibodies), ii) passive permeation through the transcellular route (using permeability assays of several reference compounds). Preliminary results were obtained indicating that active transport through glucose transporters and the efflux protein P-glycoprotein is also maintained. In addition, studies were pursued to critically assess the use of the faster-growing epithelial MDCK cells as a potential replacement for Caco-2 cells. Monolayers derived from MDCK-II, MDCK-MDR1 (overexpressing P-gp), and Caco-2 cells were systematically compared regarding morphology, tightness and permeation of several model drugs. The goal of this quantitative comparison was to evaluate the possible extension of the amount of Papp data available for QSPR studies by including data from MDCK monolayers. As expected, MDCK-MDR1 showed a higher efflux activity. The results obtained also revealed significant differences in cell and tight-junction density, which could justify the differences observed on the paracellular permeability. Finally, studies were conducted to evaluate the impact on Papp values of passive permeating compounds for some variable procedures commonly followed in permeation assays. First, the evaluation of Lucifer yellow permeability alongside with test compounds was validated as a quality control measure of cell monolayer integrity. This approach contributes to decrease the variability associated with monolayer integrity, particularly relevant when evaluating compound or mixtures with unknown effects on cell properties. Second, the use of transfer and replacement as sampling methods in multi-time assays showed to affect the measured Papp values. Insufficient homogenization of the acceptor solution in replacement assays emerged as a major cause of variability in Papp data. Third, the impact of including BSA in the transport media was assessed for a homologous series of amphiphiles with known interactions with BSA and lipid membranes. It was shown that the Papp values are affected to an extent that may revert the ranking order of the amphiphiles permeability. This may however be corrected by considering the unbound fraction of the amphiphile. This allows calculating the PappUnb which captures the permeability ranking order expected for the amphiphiles. It is mandatory that this correction is performed when compiling Papp values obtained in the presence of BSA, to reduce variability and improve data consistency, allowing the establishment of realistic QSPRs with predictive ability.

A capacidade de prever a velocidade de permeação de novas entidades químicas através das membranas biológicas é de grande importância para o seu sucesso como fármacos, uma vez que esta determina a sua eficácia, farmacocinética e segurança. Os ensaios de permeabilidade in vitro, em particular os que usam monocamadas da linha celular Caco-2, são usualmente utilizados para prever a absorção por via oral em humanos. Existe disponível na literatura uma grande quantidade de valores de permeabilidade (Papp) através de monocamada de Caco-2, estando uma fração significativa reunida em bases de dados. A compilação do Papp para grandes conjuntos de compostos permite a aplicação de ferramentas de inteligência artificial para estabelecer relações quantitativas de estrutura-permeabilidade (QSPRs) com o objetivo de prever a permeabilidade de novos compostos a partir das suas propriedades estruturais. Um dos principais desafios que dificulta a construção de previsões precisas é a existência de múltiplos valores de Papp para o mesmo composto, causada por diferenças nos protocolos experimentais utilizados. O presente trabalho tem como objetivo contribuir para o aumento do rendimento deste importante ensaio e para a diminuição da variabilidade nos dados de Papp, este último objetivo através da caracterização quantitativa do efeito de algumas das alterações experimentais mais comuns. O protocolo de referência requer o cultivo das células Caco-2 sobre membranas permeáveis durante pelo menos 21 dias para estabelecer uma monocamada coesa de células diferenciadas, que é usada num único ensaio de permeabilidade entre os dias 21 e 30. Neste trabalho, foi desenvolvida e uma metodologia para permitir a reutilização das monocamadas Caco-2 em pelo menos mais dois ensaios de permeabilidade, tendo sido implementada para ensaios aos dias 22, 25 e 28. O protocolo de re-utilização proposto foi validado relativamente i) à manutenção da coesão e integridade da monocamada de células (usando medições de TEER, ensaios de permeabilidade com marcadores da via paracelular e visualização microscópica da morfologia e abundância das junções apertadas após marcação com anticorpos fluorescentes), ii) à permeação passiva através da via transcelular (usando ensaios de permeabilidade para vários compostos de referência). Foram obtidos resultados preliminares que indicam que a permeação ativa através dos transportadores de glucose e da proteína de efluxo glicoproteína-P é também mantida. Foram também realizados estudos para avaliar criticamente o uso da linha celular epitelial de crescimento rápido, MDCK como um potencial substituto das células Caco-2. Monocamadas derivadas de células MDCK-II, MDCK-MDR1 (que sobre-expressam P-gp) e Caco-2 foram comparados sistematicamente em relação à sua morfologia, coesão e permeação de vários fármacos modelo. O objetivo desta comparação quantitativa foi avaliar a possível extensão da quantidade de dados de Papp disponíveis para estudos QSPR ao incluir os dados das monocamadas de MDCK. Como esperado, a MDCK-MDR1 mostrou uma atividade de efluxo maior. Os resultados obtidos também revelaram diferenças significativas na densidade celular e das junções apertadas. Finalmente, foram realizados estudos para avaliar o impacto nos valores de Papp de compostos que permeiam passivamente para alguns dos procedimentos variáveis que são comumente usados em ensaios de permeabilidade. Primeiramente, a avaliação da permeabilidade da Lucifer Yellow em conjunto com os compostos de teste foi validada como uma medida de controlo de qualidade da integridade da monocamada celular. Esta abordagem contribui para diminuir a variabilidade associada à integridade da monocamada, com particular relevância quando se avaliam compostos ou misturas de compostos com efeitos desconhecidos sobre as propriedades celulares. Foi também avaliado o impacto do método de amostragem (transferência ou reposição) nos valores de Papp medidos em ensaios com amostragem a vários tempos. A homogeneização insuficiente da solução aceitante nos ensaios de reposição executados na direção apical-basolateral emergiu como a principal causa da variabilidade nos dados de Papp. Por fim, o impacto da inclusão de BSA no meio de transporte foi avaliado para uma série homóloga de anfifilas em que as interações com a BSA e com membranas lipídicas são bem conhecidas. Foi demonstrado que os valores de Papp são afetados a ponto de poderem reverter a ordem de classificação da permeabilidade das anfifilas. No entanto, isto pode ser corrigido ao considerar a fração não ligada da anfifila à BSA. Este método permite calcular o valor da PappUnb, que captura a ordem de classificação de permeabilidade esperada para as anfifilas. É obrigatório que esta correção seja realizada ao compilar os valores de Papp obtidos na presença de BSA, de modo a reduzir a variabilidade e a melhorar a consistência dos dados, permitindo o estabelecimento de QSPRs realistas com capacidade preditiva.