Leucine and Arginine availability modulate mouse Embryonic Stem Cell proliferation and metabolism independently of the canonical Mammalian Target of Rapamycin pathway

Abstract

Amino acids are crucial nutrients involved in several cellular and physiological processes, including fertilization and early embryo development. In particular, Leucine and Arginine have been shown to stimulate implantation, as lack of both in a blastocyst culture system is able to induce a dormant state in embryos, similar to diapause. diapause is characterized by suspended embryo development under poor nutritional conditions, until more favorable circumstances arise. In mice diapause is triggered at the blastocyst stage, with delayed embryonic growth and proliferation, concomitant with a hypometabolic state and limited biosynthesis. Inhibition of the mammalian target of rapamycin (mTOR), using INK128 (mTi), was found to be critical in regulating diapause, and capable of inducing a diapause-like state. Moreover, this reversible state was extended to embryonic stem cells (ESCs) in culture, inducing a novel state of paused pluripotency. As a central integrative pathway, mTOR senses diverse environmental stimuli, including nutrient availability, particularly that of Leucine and Arginine, and translates these cues to coordinate several cellular processes. The aim of this work was to evaluate the effects of Leucine and Arginine withdrawal on pluripotent mouse embryonic stem cell status, notably, their growth, self-renewal, as well as glycolytic and oxidative metabolism. Our results show that the absence of both Leucine and Arginine does not affect mouse embryonic stem cell pluripotency, while reducing cell proliferation through cell-cycle arrest. Importantly, these effects are not related to Leukemia Inhibitory Factor (LIF) and are reversible when both amino acids are reconstituted in the culture media. Moreover, the lack of these amino acids is related to a reduction in glycolytic and oxidative metabolism and decreased protein translation in mouse embryonic stem cells (mESCs), while maintaining their pluripotent status. However, surprisingly, although INK128 (mTi) did indeed provoke a paused-like state, this was distinct from and less pronounced than what resulted from leucine and arginine removal, and, according to our results, these features did not seem to necessarily be mTOR-driven.

Aminoácidos são nutrientes cujo seu papel é fundamental em vários processos celulares e fisiológicos, incluindo a fertilização e o desenvolvimento embrionário inicial. Entre os diferentes aminoácidos, foi demonstrado que Leucina e a Arginina, em particular, estimulam a implantação, uma vez que a falta de ambos, no meio de cultura de blastocistos, é capaz de induzir um estado dormência nestes, semelhante à diapausa. A diapausa, por sua vez, é caracterizada pela suspensão ou interrupção temporária do desenvolvimento embrionário perante condições inadequadas, até que surjam circunstâncias mais vantajosas para que este ocorra de forma segura. Em murganhos, a diapausa é desencadeada em blastocistos, nos quais crescimento e proliferação dos blastómeros que o constituem, diminui ou para, enquanto o embrião permanece num estado hipometabólico, com biossíntese diminuida. Recentemente, foi descoberto de que a inibição da cinase mammalian target of Rapamycin (mTOR), usando o inibidor NK128 (mTi), é suficiente para induzir um estado semelhante à diapausa em laboratório. Esta inibição, para além de reversível, foi estendida a células estaminais embrionárias (ESCs) em cultura, induzindo um novo estado de pluripotência pausada. Como é uma via de sinalização central e integrativa, a via mTOR detecta diversos estímulos ambientais, incluindo a disponibilidade de nutrientes, particularmente de leucina e arginina, e traduz uma resposta celular adaptativa a esses sinais, coordenando vários processos celulares.O principal objetivo desta tese foi avaliar os efeitos da remoção de Leucina e Arginina no estado celular de células estaminias pluripotentes embrionárias de murganho, nomeadamente no seu crescimento, auto-renovação, bem como o metabolismo glicolítico e oxidativo. Os nossos resultados mostram que a cultura de células estaminias embrionárias de murganho na ausência de leucina e arginina não afeta a pluripotência destas, enquanto promove a redução da proliferação celular ao interferir com a progressão do ciclo celular. É importante salientar que estes efeitos são independentes de Leukemia Inhibitory Factor (LIF) e são reversíveis quando ambos aminoácidos são reconstituídos no meio de cultura. A remoção destes aminoácidos promove, também, uma redução no metabolismo glicolítico e oxidativo, bem como uma diminuição da tradução proteica em células estaminais embrionárias de ratinho, porém, preservando a natureza pluripotente destas células. Surpreendentemente, embora o inibidor INK128 (mTi) tenha, de facto, provocado um estado de pluripotência pausada, este foi diferente e menos pronunciado do que o que resultou da remoção de leucina e arginina. De acordo com os nossos resultados, as características induzidas pela ausência destes aminoácidos, não parecem, necessariamente, ser diretamente dependentes e reguladas pela via mTOR.