Metabolomic and proteomic approaches to characterize the role of epigenetics on Pinus halepensis Mill. somatic embryogenesis

Abstract

As árvores são parte fundamental de um dos mais importantes ecossistemas terrestres: as florestas. O elevado valor ecológico e socioeconómico que as florestas apresentam, acompanhado das ameaças climáticas e antropológicas que regularmente enfrentam, torna imperativo melhorar a qualidade e produtividade das árvores florestais. Assim, entender como os fatores climáticos impactam o seu funcionamento, sobrevivência e adaptação é crucial para antecipar as consequências que eventos ambientais extremos podem ter sobre esses ecossistemas. A cultura in vitro é um conjunto de técnicas biotecnológicas que permite, entre outras coisas, clonar plantas. Ainda que o desenvolvimento embrionário represente um período muito curto na vida de uma árvore, a embriogénese somática, uma técnica de propagação em larga escala, provou ser uma ferramenta importante para caracterizar os vários mecanismos envolvidos na resposta ao stresse e adaptação das plantas. As coníferas são as árvores mais comuns em vastas áreas do Hemisfério Norte, sendo o género Pinus crucial para a indústria madeireira e de grande importância ecológica devido à sua ampla distribuição mundial. O pinheiro-do-Alepo (Pinus halepensis), a espécie em estudo, é uma espécie mediterrânica com uma plasticidade ecológica significativa, o que tem contribuído para a sua utilização em programas de (re)florestação. Assim sendo, o principal objetivo deste trabalho foi a indução de uma “memória” epigenética ao stresse, através da aplicação de elevadas temperaturas na fase de iniciação da embriogénese somática de P. halepensis para estudar os efeitos do stresse térmico na eficiência da embriogénese somática, e como ferramenta para compreender os mecanismos subjacentes à resposta ao stresse das coníferas. Para isso, diferentes tratamentos foram aplicados durante a indução das massas embrionárias (40 ℃ por 4 h, 50 ℃ por 30 min e 60 ℃ por 5 min). Para avaliar como o stresse térmico pode afetar o sucesso das diferentes etapas da embriogénese somática, foram recolhidos dados ao longo das diferentes fases. Da mesma forma, para compreender os mecanismos de resposta ao stresse térmico, a análise dos efeitos dos tratamentos aplicados na concentração endógena de citocininas, na caracterização morfológica das culturas embriogénicas, no proteoma e na concentração relativa de carboidratos e aminoácidos das massas embrionárias obtidas foram analisados. Foram ainda avaliadas as taxas de metilação do DNA e a expressão diferencial de quatro genes relacionados ao stresse em massas embrionárias e agulhas de plantas somáticas in vitro. Todos os tratamentos de indução permitiram a obtenção de plantas, sugerindo a possibilidade de induzir embriogénese somática sob stresse térmico em P. halepensis, e não se detetaram diferenças significativas entre as taxas de iniciação, proliferação, maturação ou germinação; os tratamentos aplicados durante a fase de iniciação da embriogénese somática não levaram à perda de variedade genética comparativamente às condições controlo (23 ℃ por 9 semanas). No entanto, uma diferença significativa foi encontrada no que toca à produção de embriões somáticos, tendo o maior número de embriões sido obtido em amostras induzidas a 60 ℃ (5 min). Deste modo, este tratamento térmico parece ter desencadeado um efeito positivo na eficiência do processo, reforçando-a. A análise da concentração endógena de citocininas mostrou que as diferentes condições aplicadas durante a fase de iniciação da embriogénese somática levaram a diferentes perfis hormonais. Não foram encontrados níveis de metilação do DNA significativamente diferentes, mas as pequenas flutuações encontradas podem estar relacionadas com o processo embriogénico, e variações na expressão diferencial de genes relacionados ao stresse foram obtidas ao longo de diferentes fases da embriogénese. Finalmente, foram identificadas 27 proteínas relacionadas com a resposta ao stresse térmico, sendo que a maioria das proteínas acumuladas em massas embrionárias induzidas a temperaturas mais elevadas estarão envolvidas na regulação do metabolismo, ligação ao DNA, divisão celular, regulação da transcrição e no ciclo de vida das proteínas. Além disso, foram encontradas diferenças significativas nas concentrações de sacarose, glutamina, glicina e cisteína. Em conclusão, a aplicação do stresse térmico na fase inicial da embriogénese somática provocou efeitos que se mantiveram ao longo de diferentes fases do processo, e permitiu a identificação de citocininas, proteínas, genes relacionados ao stresse e metabólitos específicos envolvidos nos intrincados mecanismos subjacentes à resposta ao stresse e/ou ao processo embriogénico das coníferas. Paralelamente, tentou-se desenvolver protocolos eficientes de embriogénese somática e organogénese para material adulto. Neste sentido, a primeira descrição de um protocolo de regeneração in vitro de árvores adultas de P. halepensis, por meio de organogénese, foi concretizada no âmbito desta tese.

Trees are fundamental players of one of the most important terrestrial ecosystems: forests. The immeasurable ecological and socio-economic value that forests represent, accompanied by the anthropological and climatic threats they regularly face, makes it imperative to improve forest trees quality and productivity. On this matter, a deeper understanding on how climatic factors impact tree’s function, survival and adaptation is crucial for anticipating the consequences that the extreme environmental events foreseen may have on these ecosystems. The in vitro culture is a set of biotechnological techniques that allows, among other things, to clone plants. Even though embryogenesis is a very short period at the lifespan of a tree, somatic embryogenesis, a large-scale propagation technique, proved to be a valuable tool to characterize the various mechanisms involved in stress response and adaptation of plants. Conifers are the most common trees in some vast areas of the Northern Hemisphere and the Pinus genus, of crucial importance for the wood-based industries, has high ecological importance due to its wide distribution around the globe. Aleppo pine (Pinus halepensis), the species under study, is a Mediterranean species with significant ecological plasticity, which has contributed to its use in (re)afforestation programs. With this as background, the main goal of this work was to trigger the formation of a long-lasting epigenetic “stress memory”, through the application of high temperatures during the initiation stage of P. halepensis somatic embryogenesis to study the influence of heat stress regarding the success of the somatic embryogenesis process, and as a tool to understand the mechanisms underlying stress-response in conifers. For this matter, different temperature treatments were applied during the induction of embryonal masses (40 ℃ for 4 h, 50 ℃ for 30 min, and 60 ℃ for 5 min). To assess how heat stress could affect the success of the different stages of the process, data were collected along the different steps of somatic embryogenesis. Likewise, to understand the mechanisms underlying temperature stress response, analyses regarding the effect of the temperature treatments applied on the endogenous concentration of cytokinins, the morphological characterization of the embryogenic cultures, the proteome and the relative concentration of soluble sugars, sugar alcohols and amino acids of the obtained embryonal masses were performed. Also, changes in the DNA methylation rates and the differential expression of four stress-related genes in embryonal masses and needles from in vitro somatic plants were evaluated. It was possible not only to obtain plants from all induction treatments, suggesting the opportunity to induce somatic embryogenesis under heat stress in P. halepensis, but also to assess that there were no significant differences between initiation, proliferation, maturation, or germination rates for the different treatments assayed; the high temperature pulses applied during the initiation phase of somatic embryogenesis did not translate into genetic variety loss when compared to the standard conditions (23 ℃ for 9 weeks). Though, a significant difference was found at the production of somatic embryos, and the highest number was obtained at samples induced at 60 ℃ (5 min). In this sense, this specific temperature treatment appeared to have triggered a positive effect on the efficiency of the process, strengthening it. The analysis of endogenous concentration of cytokinins showed that different conditions applied during the initiation phase of somatic embryogenesis led to different hormonal profiles. No significantly different levels of DNA methylation were found, but small fluctuations were seemingly related with the embryogenic process, and long-lasting variations in the differential expression of stress-related genes were obtained. Finally, 27 proteins related to heat stress response were identified, with the majority of the proteins up-accumulated in embryonal masses induced at higher temperatures being involved in the regulation of metabolism, DNA binding, cellular division, transcription regulation and the life-cycle of proteins. Also, significant differences in the concentrations of sucrose, glutamine, glycine and cysteine were found. In conclusion, the application of heat stress at the initial stage of somatic embryogenesis provoked long-lasting effects throughout the process, and allowed to identify specific cytokinins, proteins, stress-related genes and metabolites involved in the intricate mechanisms underlying stress response and / or the embryogenic process in conifers. In parallel, the establishment of efficient protocols for somatic embryogenesis and organogenesis of mature material was attempted. In this regard, the first report of a successful protocol for in vitro regeneration of P. halepensis adult trees through organogenesis was developed in the framework of this thesis.