Exploring protein-protein and protein-RNA interactions in Influenza virus’ non-structural protein 1 (NS1)

Abstract

A gripe, provocada pelo vírus Influenza, é uma doença viral contagiosa, que ataca o trato respiratório e que se espalha pela população mundial, anualmente em infeções sazonais. De facto, a cada ano, cerca de 10% da população mundial é infetada e mais de 650.000 pessoas morrem de Influenza de acordo com a Organização Mundial de Saúde. Os vírus influenza pertencem à família Orthomyxoviridae e possuem um genoma de RNA de cadeia simples de 8 segmentos de sentido negativo que codifica 11 proteínas diferentes. A disseminação da influenza no mundo é controlada por vacinas sazonais, atualizadas anualmente de acordo com as estirpes virais em circulação. No entanto, devido às altas taxas de mutação e sortimento genético recorrente, novas estirpes virais são disseminadas anualmente aumentando a possibilidade de uma pandemia. Uma vez que a eficácia da vacinação é limitada, são necessárias novas abordagens preventivas e terapêuticas e uma melhor compreensão das interações vírus-hospedeiro.O papel da proteína não estrutural 1 (NS1) do Influenza e suas conhecidas interações na célula hospedeira são fundamentais para entender melhor os mecanismos de infeção e replicação do vírus e propor abordagens futuras para o desenvolvimento de novos antivirais com diferentes mecanismos de ação daqueles atualmente no mercado. Neste trabalho, realizamos estudos in-silico para melhor compreender a estrutura, dinâmica e interações da NS1, de forma que a ação central desempenhada pela proteína se estabeleça como um verdadeiro alvo farmacológico para combater o Influenza. A NS1 pode estar presente na célula infetada do hospedeiro como um monómero ou como um homodímero e pode co-localizar-se em vários compartimentos celulares como o citoplasma, o núcleo, o nucléolo ou a mitocôndria. Esta proteína hub viral é mestre em estabelecer interações proteína-proteína (PPIs) para evitar a resposta imune do hospedeiro.Assim, no âmbito desta tese, foram realizadas e analisadas simulações de Dinâmica Molecular (MDs) da proteína NS1 e alguns dos seus complexos. Adicionalmente, foram realizadas simulações de docking para melhor compreender o papel dos contactos inter-moleculares na interface proteína-proteína na estrutura cristalográfica do complexo NS1:TRIM25 e como estes contactos se traduziriam em estruturas não-conhecidas de complexos com a proteína NS1 das estirpes virais H5N1, com um linker mais curto, e H6N6, com um linker mais longo, de forma a avaliar o papel do linker na plasticidade conformacional da proteína. Análise de componentes principais (PCA) sobre as trajetórias das MDs produziram 7 clusters conformacionais para a NS1 da estirpe H5N1 e 5 clusters para a NS1 da estirpe H6N6. Surpreendentemente, análises posteriores demonstraram que a NS1 de H5N1 acede um espaço conformacional maior, apesar do linker mais curto.Uma vez que o foco desta tese foi o estudo de interfaces, um estudo estatístico também foi fundamental e trouxe alguns insights importantes sobre os hotspots e como suas propriedades físico-químicas afetam a sua capacidade nos processos de binding entre as biomoléculas. Foi produzida uma multiplicidade de resultados como a proporção de aminoácidos, enriquecimento e conservação em PPIs, juntamente com uma caracterização abrangente, fornecendo uma análise estatística robusta de interfaces PPI em massa, crucial para avaliar sua importância para descobertas biológicas adicionais. O resultado deste trabalho é a base de dados a que chamamos de hot-spots knowledge base (HOOKED). O algoritmo de classificação da HOOKED foi aplicado a um conjunto de dados não redundante de 1228 complexos proteína-proteína, onde previmos um total de 3123 HS, com cada complexo tendo, em média, 2,54 HS. Somando-se às descobertas gerais que corroboram estudos anteriores de HS, também observamos que não apenas a frequência de resíduos, mas também o enriquecimento de resíduos nas regiões do rim e support são quase idênticos aos da superfície (mais polares) e do core (mais apolares), respetivamente. Os resíduos mais conservados como HS foram Leu, Trp e Gly. Trp foi enfatizado mais uma vez como altamente conservado na interface e como HS, particularmente nas regiões de core e support. Resíduos interfaciais de superfície e rim apresentaram maior flutuação de normal mode analysis (NMA), enquanto resíduos de HS, especialmente na região de support, apresentam valores muito mais baixos, com desvios padrões muito menores. Isso implica que os resíduos mais relevantes para a formação de complexos geralmente exibem menor capacidade de movimento dentro da interface.

Influenza (flu) is a contagious viral disease, which targets the respiratory tract, and spreads through the world population each year in seasonal epidemics. In fact, every year around 10% of the world population is infected and over 650.000 people die from Influenza according to the World Health Organization. Influenza viruses belong to the family Orthomyxoviridae and have a negative-sense, 8 segment-single-stranded RNA genome that encodes 11 different proteins. Influenza spreading around the World is controlled by seasonal vaccines, updated annually according to the viral strains in circulation. However, due to high rates of mutation and recurrent genetic assortment, new viral strains disseminate yearly increasing the possibility of a pandemic. Since the vaccination’s efficacy is limited, new preventive and therapeutic approaches and better understanding of the virus-host interactions are needed. The role of the non-structural protein 1 (NS1) of Influenza and its known interactions in the host cell are pivotal to better understand the mechanisms of infection and replication of the virus and propose future perspectives into the development of new antivirals with different mechanisms of action from the ones currently in the market. Herein, we carried out in-silico studies to better understand NS1’s structure, dynamics and main interactions, so that this central-action protein can be established as a real pharmacological target to tackle Influenza. NS1 is present in the host´s infected cells as a monomer or as a homodimer and can co-locate in several cellular compartments as the cytoplasm, the nucleus, the nucleolus, or the mitochondria. This viral hub protein is a master in establishing protein-protein interactions (PPIs) to evade the host’s immune response. Hence, in the scope of this thesis, Molecular Dynamics simulations (MDs) of NS1 were conducted and analyzed. Additionally, we performed docking simulations to better understand the role of inter-molecular contacts in the interface of a published x-ray crystal structure of the NS1:TRIM25 complex and how they could translate into unknown complexes with NS1 from the H5N1 viral strain, with a shorter linker, and H6N6, with a longer linker, in order to assess the impact of the linker in the protein´s conformational plasticity. Principal Component Analysis (PCA) on the MDs trajectories could retrieve 7 conformational clusters for the H5N1 strain and 5 clusters for the H6N6 strain. Surprisingly, further analysis demonstrated that H5N1 populates a larger conformational space despite the shorter linker. Since the focus of this thesis was the study of protein-protein interfaces, a statistical study was also pivotal and brought some key insights regarding hot spots and how their physico-chemical properties affect their ability to be central in the binding processes. A variety of results were produced regarding amino acids proportion, enrichment, and conservation at PPIs along with a comprehensive characterization providing a robust statistical analysis of bulk PPI interfaces, key to assess their significance for further biological findings. We developed a comprehensive knowledge database, the hot-spots knowledge base (HOOKED) SpotON classification algorithm was applied to a non-redundant dataset of 1228 protein-protein complexes where we predicted a total of 3123 HS, with each complex having on average, 2.54 HS. Adding to overall findings that corroborate previous HS studies, we also observed that not only residue frequency but also residue enrichment at the rim and support regions were nearly identical to those of the surface (more polar) and core (more nonpolar), respectively. Trp was stressed once more as highly conserved HS, particularly at the core and support regions. Surface and interfacial rim residues showed higher normal mode analysis (NMA) fluctuation whereas HS residues, especially at support region showed much lower values, with much lower standard deviations. This implies that the more relevant residues for complex formation usually display lower movement capability within the interface.