Astrocytic adenosine A2A receptor and connexin43 crosstalk in Alzheimer's disease

Abstract

Os astrócitos são um tipo de células gliais abundante no sistema nervoso central (SNC) onde desempenham funções importantes e são reconhecidos como um elemento funcional da sinapse. Os astrócitos são capazes de sentir a atividade neuronal, captar neurotransmissores da fenda sináptica e, por sua vez, regular a atividade sináptica liberando gliotransmissores, tais como ATP e glutamato, por diferentes mecanismos, nomeadamente através de hemicanais. A proximidade entre astrócitos e terminais sinápticos permite a comunicação bidirecional entre astrócitos e neurónios, originando o conceito de sinapse tripartida. Assim, alterações nas funções astrocíticas podem afetar a função sináptica e, em última análise, a memória. A disfunção astrocítica tem sido cada vez mais implicada na patogénese da doença de Alzheimer (DA). A DA é uma patologia neurodegenerativa caracterizada pela perda progressiva de funções cognitivas, associada à acumulação de peptídeos β-amilóide (βA) que se podem agregar em placas. Na DA, foi relatada a desregulação de múltiplas funções astrocíticas, nomeadamente, o aumento da liberação de gliotransmissores e da atividade dos hemicanais, que são compostos principalmente por conexina (Cx) 43.Os recetores de adenosina A2AR (A2AR) são reconhecidos como um potencial alvo para controlar disfunções na DA, uma vez que foi mostrado que o seu bloqueio é protetor em múltiplos modelos de DA. Adicionalmente, o nosso grupo e outros mostraram que os A2AR controlam funções astrocíticas afetadas na DA, nomeadamente, a captação de glutamato, as dinâmicas de Ca2+ e a expressão de genes envolvidos na resposta neuroinflamatória. Assim, neste estudo pretendeu-se investigar uma possível interação funcional entre A2AR e Cx43 e avaliar o potencial da sua manipulação no controle da disfunção astroglial na DA.O presente estudo reporta que os A2AR controlam a atividade de hemicanais astrogliais em condições não patológicas e patológicas que mimetizam a DA. Em culturas primárias de astrócitos, identificou-se, pela primeira vez, uma associação física entre A2AR e Cx43 e um ciclo de feedback positivo estimulado pela exposição a peptídeos βA envolvendo A2AR e hemicanais compostos por Cx43. A ativação dos A2AR aumenta a atividade de hemicanais constituídos por Cx43 levando a um aumento da liberação de ATP, que é posteriormente metabolizado em adenosina por CD73, sustentando a ativação de A2AR.Adicionalmente investigaram-se alterações na atividade de hemicanais em modelos experimentais de DA, e observou-se um aumento na atividade de hemicanais em murganhos APP/PS1 portadores de placas e em dois modelos de DA precoce sem placas: murganhos com administração intracerebroventricular (icv) de Aβ1-42 e fatias de hipocampo superfundidas com peptídeos βA1-42. Assim, apesar do aumento da atividade de hemicanais astrogliais ser induzido por βA, não depende da formação de placas. Também se explorou o mecanismo pelo qual os A2AR controlam hemicanais constituídos por Cx43 e observou-se que, em modelos de DA precoce, a atividade de hemicanais é regulada pela fosforilação de Cx43 no resíduo Ser368, tipicamente fosforilado pela proteína quinase C (PKC). Em fases mais tardias, caracterizadas pela presença de placas, o aumento da atividade de hemicanais foi relacionado com o aumento dos níveis de Cx43. Estas descobertas indicam que a atividade dos hemicanais é regulada diferencialmente ao longo da progressão da doença. Além disso, a fosforilação de Cx43 por PKC parece ocorrer após a ativação de A2AR, sugerindo uma mudança da via de sinalização canónica de A2AR em condições que mimetizam a DA. Globalmente, os resultados indicam que os A2AR têm o potencial de controlar a atividade de hemicanais por duas vias: i) interação física entre A2AR e Cx43 e ii) fosforilação de Cx43 por PKC após ativação de A2AR.Além disso, estabeleceu-se e caracterizou-se um novo modelo animal para investigar seletivamente o impacto do silenciamento de A2AR astrocíticos no hipocampo de murganhos adultos. Este estudo mostrou a importância dos A2AR astrogliais na comunicação sináptica do hipocampo e em processos de memória. O silenciamento dos A2AR astrocíticos afetou a complexidade morfológica dos astrócitos e aumentou a atividade de hemicanais, além dos níveis de Cx43 (total e fosforilada na Ser368), reforçando o papel dos A2AR na modulação da atividade de hemicanais em condições não patológicas.Resumindo, os resultados mostram que os A2AR controlam a atividade de hemicanais astrocíticos e são mediadores da comunicação bidirecional astrócitos-neurónios na sinapse tripartida. A atividade de hemicanais astrogliais aumenta em diferentes modelos experimentais mimetizando a DA, contribuindo para apoiar o papel da disfunção astroglial na DA. Isto sugere ser importante desenvolver estratégias para manipular a disfunção astrocítica na DA e os A2AR podem ser um alvo promissor, uma vez que controlam múltiplas funções astrogliais afetadas na DA.

Astrocytes are a type of glial cells that are abundant in the central nervous system (CNS), where they play several important functions, being recognized as a functional element of the synapse. Astrocytes are able to sense neuronal activity, uptake neurotransmitters from the synaptic cleft, and in turn regulate synaptic activity by releasing gliotransmitters (such as ATP and glutamate) by different mechanisms, namely through hemichannels. The close proximity between astrocytes and synaptic terminals allows a bidirectional communication between astrocytes and neurons, which gave rise to the concept of the tripartite synapse. Thus, alterations in astrocytic functions can affect synaptic function and, ultimately, memory. Indeed, increasing evidence supports astrocytic dysfunction as a key event in the pathogenesis of Alzheimer’s disease (AD). AD is a neurodegenerative disorder characterized by a progressive decline in cognitive functions, linked to the accumulation of amyloid-β (Aβ) peptides, which can aggregate into plaques. In AD, the dysregulation of multiple astroglial functions was reported, namely an upregulation of gliotransmitters release and hemichannels activity, which are mainly composed of connexin (Cx) 43.Adenosine A2AR receptors (A2AR) are recognized as a potential target to manage alterations in AD, since their blockade has been shown to be protective in multiple AD models. Additionally, our group and others showed that A2AR control key astrocytic functions affected in AD, for instance, glutamate uptake, Ca2+ dynamics and the expression of genes involved in neuroinflammatory response. Therefore, the present study was aimed to investigate a putative crosstalk between A2AR and Cx43 hemichannels and assess the potential of their manipulation in controlling astroglial dysfunction in AD. It is now reported that A2AR control the activity of astrocytic hemichannels in non-pathological and pathological conditions mimicking AD. In primary cultures of astrocytes, it was identified, for the first time, a physical association between A2AR and Cx43 and a feed-forward loop prompted by Aβ peptides exposure and involving A2AR and Cx43 hemichannels. A2AR bolster the activity of Cx43 hemichannels leading to increased ATP release, which is further metabolized by CD73 into adenosine, further sustaining A2AR activation.Alterations in hemichannels activity were also investigated in experimental models of AD, showing an enhancement in hemichannels activity in plaque-bearing APP/PS1 mice and in two models of early AD lacking amyloid plaques: mice with intracerebroventricular (icv) administration of Aβ1-42, and hippocampal slices superfused with Aβ1-42 peptides. Thus, although the upregulation of astroglial hemichannels is triggered by Aβ, is not dependent on the formation of plaques. The mechanism by which A2AR control Cx43 hemichannels was also explored and it was observed that, in early AD, hemichannels activity was regulated by Cx43 phosphorylation at Ser368 residue, known to be phosphorylated by protein kinase C (PKC). In latter stages, characterized by the presence of amyloid plaques, the increase in hemichannels activity was instead related to an increase in Cx43 levels. These findings indicate that hemichannels activity is differentially regulated throughout disease progression. Moreover, Cx43 phosphorylation by PKC appears to occur downstream of A2AR activation, suggesting a shift from the A2AR canonical PKA signalling pathway in conditions mimicking AD. Overall, these data indicate that A2AR have the potential to control hemichannels activity through two pathways: i) physical interaction between A2AR and Cx43 and ii) phosphorylation of Cx43 by PKC following A2AR activation. Moreover, a novel animal model was established and characterized to selectively investigate the impact of astrocytic A2AR silencing in the hippocampus of adult mice. This allowed demonstrating a crucial role of astroglial A2AR in hippocampal synaptic communication and in memory processes. Astrocytic A2AR silencing also affected the morphological complexity of astrocytes and upregulated hemichannels activity in addition to Cx43 (total and phosphorylated) levels, further supporting the role of A2AR in the modulation of hemichannels activity in non-pathological conditions.Summarizing, the results presented here show that A2AR control astroglial hemichannels activity and are mediators of astrocyte-neuron bidirectional communication within the tripartite synapse. The activity of astroglial hemichannels increases in multiple experimental models mimicking AD, contributing to further support astroglial dysfunction in AD. Therefore, it is of utmost importance to develop strategies to manipulate astrocytic dysfunction in AD and A2AR can be a promising target, since they control multiple astroglial functions affect in AD.