Novel Personalized therapies for cystic fibrosis in a pediatric population

Abstract

A Fibrose Quística (FQ) é a doença autossómica recessiva limitante da vida mais comum em caucasianos. Esta doença genética é causada por variantes no gene regulador da condutância transmembranar da FQ (CFTR) que codifica um canal de cloreto (Cl-) na membrana plasmática apical das células epiteliais. Variantes no gene CFTR originam secreções anormalmente viscosas responsáveis por uma grande variabilidade de manifestações clínicas em diferentes órgãos. Novos medicamentos que visam variantes específicas do gene CFTR já entraram na prática clínica, mas não se aplicam às mais de 2,000 variantes descritas, excluindo indivíduos com variantes raras. Estes moduladores de CFTR estão divididos em dois grupos: potenciadores (Ivacaftor) e corretores (Lumacaftor, Tezacaftor e Elexacaftor). Este trabalho teve como objetivo principal a caracterização clínica e genética de uma coorte de indivíduos com FQ para uma potencial intervenção terapêutica personalizada com moduladores de CFTR utilizando organoides intestinais. Foi realizada a caracterização clínica e genética de uma coorte de 23 pessoas com FQ (pwCF) em idade pediátrica seguidos no Hospital Pediátrico - Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra. Todos os indivíduos têm a variante p.Phe508del em pelo menos um alelo. Quinze pwCF p.Phe508del-homozigóticos são elegíveis para terapia dupla (Luma/Teza+Iva) e para terapia tripla (Teza+Iva+Elexa). As pwCF com as variantes de função mínima c.579+1G>T (n=2), p.Gln685ThrfsX4 (n=1) e c.3321dup (n=1) são elegíveis para terapia tripla. Os doentes com uma variante com função residual: p.Arg334Trp (n=3) e p.Pro5Leu (n=1) têm um fenótipo menos grave, no entanto, em Portugal, não têm atualmente nenhuma terapia disponível. A caracterização genética e molecular de pwCF representa um passo importante não apenas para o diagnóstico e prognóstico da FQ, que está fortemente relacionado com o fenótipo clínico, mas também para a elegibilidade de medicamentos moduladores de CFTR.Nesta coorte de 23 pwCF, foi também analisada a associação entre as características clínicas e o valor de calprotectina fecal (um marcador de inflamação intestinal). Dezassete (17/23) pwCF apresentavam calprotectina elevada e o valor mediano foi de 88 µg/g (IQR=17µg/g). Nos indivíduos com insuficiência pancreática (IP) foi observada calprotectina mais elevada (101vs30µg/g, P=0.027). Não foi encontrada associação entre calprotectina elevada e o estado nutricional ou a presença de sintomas digestivos. Em 11 destes indivíduos, foram obtidas biópsias retais e foi encontrada inflamação retal focal inespecífica nas amostras de quatro (4/11). Este achado apresentou uma associação significativa com o valor elevado da calprotectina (p=0.015). A sensibilidade foi de 100% e a especificidade de 86%. Nesta coorte de pwCF, a elevação da calprotectina fecal foi frequente, principalmente nos com IP, e estava presente nos indivíduos com evidência histológica de inflamação retal. A calprotectina fecal pode ser um indicador de inflamação retal assintomática em indivíduos com FQ.As biópsias retais dos mesmos 11 indivíduos foram utilizadas para determinar a função residual de CFTR e para prever respostas aos fármacos moduladores de CFTR. A secreção de Cl- mediada por CFTR foi avaliada por medições de voltagem intestinal (IVM) em câmara de Ussing. Paralelamente, os organoides intestinais foram preparados, cultivados e analisados pelo ensaio de Inchamento Induzido por Forscolina (FIS) com microscopia confocal, antes e após incubação com os moduladores, nomeadamente: Iva, Teza/Iva ou Elexa/Teza/Iva. Os oito pwCF com variantes raras e p.Phe508del no outro alelo foram incluídos: três com p.Arg334Trp e um com p.Pro5Leu (que têm um fenótipo atípico e, efetivamente, exibem função residual CFTR em ambos os ensaios IVM e FIS); dois com c.579+1G>T, um com p.Gln685ThrfsX4 e um com a variante não descrita anteriormente c.3321dup (que têm um fenótipo CF clássico e nenhuma função CFTR no ensaio IVM e FIS). Três pwCF p.Phe508del- homozigóticos também participaram do estudo, dois não apresentavam função residual de CFTR (no terceiro os resultados foram inconclusivos). A proteína CFTR foi resgatada por Teza/Iva em organoides com variantes p.Arg334Trp e p.Pro5Leu. No entanto, esta combinação falhou em resgatar a função CFTR nos organoides p.Phe508del-homozigóticos e nos organoides com as variantes c.579+1G>T, p.Gln685ThrfsX4, c.3321dup. A terapia tripla Elexa/Teza/Iva resgatou significativamente a proteína CFTR nos organoides de cinco pwCF: dois com a variante c.579+1G>T, um com p.Arg334Trp e dois p.Phe508del-homozigóticos. Estes resultados evidenciam o interesse da utilização de organoides intestinais na previsão da resposta individual aos moduladoras de CFTR, indicando que pwCF com as variantes p.Arg334Trp ou p.Pro5Leu podem beneficiar do tratamento com Teza/Iva. Uma resposta clínica mais significativa é esperada para a terapia tripla em pwCF com a variante p.Phe508del em pelo menos um alelo.

Cystic Fibrosis (CF) is the most common life-limiting autosomal recessive disease among Caucasians. This genetic disease is caused by variants in the CF transmembrane conductance regulator (CFTR) gene which encodes a chloride (Cl-) channel in the apical plasma membrane of epithelial cells. Variants in the CFTR gene cause abnormally viscous secretions responsible for a wide variability of clinical manifestation in different organs. New approved drugs that target specific gene CFTR variants have entered clinical practice but do not apply to all of the 2,000 CFTR variants reported, excluding individuals with rare variants. These CFTR modulators are divided in two main groups: potentiators (Ivacaftor) and correctors (Lumacaftor, Tezacaftor and Elexacaftor). The main objective of this doctoral work is to characterize clinically and genetically a small paediatric cohort of individuals with CF for a potential personalized therapeutic intervention with CFTR modulators using intestinal organoids.A cohort of 23 paediatric people with CF (pwCF) undergoing follow-up at Hospital Pediátrico – Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra had their clinical and genetic features analysed in order to determine which ones are candidates to CFTR modulators. All individuals have the p.Phe508del variant in at least one allele. Fifteen pwCF were p.Phe508del-homozygous and are eligible for dual therapy (Luma/Teza+Iva) and for triple therapy (Teza+Iva+Elexa). pwCF with c.579+1G>T (n=2), p.Gln685ThrfsX4 (n=1) variants and a novel variant c.3321dup (n=1) have minimal function variant and a classic phenotype which also makes them eligible to triple therapy. Patients with a residual function variant: p.Arg334Trp (n= 3) and p.Pro5Leu (n=1) have a less severe phenotype, however in Portugal, they have at present no available therapy. Genetic and molecular characterization of pwCF poses an important step not just for CF diagnosis and prognosis which is tightly correlated with the clinical phenotype, but also for the eligibility of CFTR modulator drugs.In this cohort of 23 paediatric pwCF the association of faecal calprotectin (a biomarker of intestinal inflammation) with the clinical characteristics was analysed. Seventeen (17/23) pwCF had elevated faecal calprotectin, and the median value was 88µg/g (IQR=178µg/g). Higher faecal calprotectin levels were observed in the pancreatic insufficient (PI) group (101vs30 µg/g, P=0.027). No significant association between elevated faecal calprotectin and nutritional status or gastrointestinal symptoms was found. In 11 of these individuals, rectal biopsies were obtained and unspecific focal rectal inflammation was found in four individuals (4/11). This finding was associated with elevated faecal calprotectin (p=0.015). Sensitivity was 100% and specificity was 86%. In pwCF analysed here, elevated faecal calprotectin was frequent, particularly if PI, and it was present in individuals with histologic evidence of rectal inflammation. Faecal calprotectin may be an indicator of asymptomatic rectal inflammation in pwCF.Rectal biopsies from the same 11 pwCF were used in order to determine CFTR residual function and to predict specific responses to approved CFTR modulator drugs. CFTR-mediated Cl- secretion was assessed by Ussing chamber intestinal voltage measurements (IVM). In parallel, intestinal organoids were prepared, cultured and analysed using the Forskolin-Induced Swelling (FIS) assay by confocal microscopy, before and after incubation with modulators, namely: Iva, Teza/Iva or Elexa/Teza/Iva. The eight pwCF with rare variants and p.Phe508del in the other allele, were included: three with p.Arg334Trp and one with p.Pro5Leu (who have an atypical phenotype and in fact, exhibit CFTR residual function in both IVM and FIS assays); two with c.579+1G>T, one with p.Gln685ThrfsX4 and one with the variant c.3321dup (who have a classical CF phenotype and no CFTR function in IVM and FIS assays). Three pwCF who were homozygous for p.Phe508del with variable clinical phenotype also participated, two had no residual CFTR function (and one with no conclusive analysis). CFTR was rescued by Teza/Iva in organoids with p.Arg334Trp and p.Pro5Leu variants. However, this combination failed to rescue CFTR function in c.579+1G>T, p.Gln685ThrfsX4, c.3321dup and p.Phe508del-homozygous organoids. Triple therapy Elexa/Teza/Iva significantly rescued CFTR in organoids from five pwCF: two with c.579+1G>T, one with p.Arg334Trp and two p.Phe508del -homozygous. Our results illustrate the value of using intestinal organoids to predict individual responses to approved CFTR modulator drugs, indicating that individuals with CF bearing p.Arg334Trp or p.Pro5Leu variants may benefit from treatment with double therapy of CFTR modulators. A more significant clinical benefit is expected for the triple therapy in pwCF carrying the p.Phe508del variant in at least one allele.