Expression of the transferrin receptor and permeability of the blood brain barrier in ischemic stroke

Abstract

Stroke remains one of the main causes of mortality and morbidity worldwide. Current therapies are aimed at reversing the loss of blood flow to the brain preventing subsequent ischemic damage. However, these therapies are highly limited by their narrow therapeutic window, and additional research to identify new neurorestorative treatments is unquestionably required. The blood-brain barrier (BBB) poses the main hurdle for brain delivery of therapeutic agents. On the other hand, it also expresses a high number of surface receptors, key to its physiological function, that represent a potential platform for directed drug delivery. To this aim, the transferrin receptor (TfR) has emerged as a promising candidate due to its up-regulated expression in the BBB. After a stroke, BBB properties follow a dynamic process that evolves throughout different phases, from initial injury to repair. Although its precise biological substrate is yet to be deciphered. This shifting pattern can alter the expression of BBB receptors. Specifically, in the subacute phase of stroke, angiogenesis is recognized as one of the main processes promoting tissue repair and has been associated with increased BBB permeability (BBBp). Moreover, developing vessels have enhanced iron metabolism, overexpressing TfR. Hence, in response to the ischemic insult, TfR may also play a decisive role during subacute vascular remodelling, representing an ideal target for therapeutic delivery. In this project, we used a translational and multidisciplinary approach to understand how the BBBp evolves post-stroke and the association between subacute BBBp and TfR expression, ultimately aiming to identify an improved delivery platform for directed neuronal tissue recovery therapies after stroke.To clarify the time course of BBBp during stroke phases we performed a systematic review and meta-analysis. We included all relevant research up to December 31, 2021, and computed BBBp as the standardized mean difference (SMD) between the ipsilateral and contralateral sides of the brain. The expression of the TfR in the subacute BBB was evaluated in an observational prospective study of patients with 18-80 years old and middle cerebral artery (MCA) acute ischemic stroke. Patients were subjected to full clinical evaluation upon admission. All subjects underwent positron emission tomography (PET) scan and magnetic resonance imaging (MRI) seven days after stroke onset. MRI involved dynamic contrast enhancement to quantify BBBp. TfR expression was evaluated semi-quantitatively by calculating 68Ga-citrate’s standardized uptake value (SUV). Follow-up at three months included an additional MRI scan to evaluate the ischemic lesion, functional outcome assessment through the modified Rankin scale and neurological evaluation through the National Institutes of Health Stroke Scale. To confirm the suitability of 68Ga-citrate as a marker of TfR expression in the BBB, we performed an in vitro assay using a human BBB model. The meta-analysis included 22 studies and 1592 patients, documenting a continuous increase in BBBp for at least 30 days. Peak increase was documented between the acute-subacute phases. This analysis revealed that the extent of BBBp impacts patients’ outcomes depending on the stroke phase, with the late subacute phase (7-10 days) being key for improved clinical outcomes. The study population consisted of 30 patients with a median age of 72.5 (64-77) years. Our results indicate that in the subacute phase of stroke, there is an overexpression of the TfR within the ischemic brain. This increase is concurrent with increased BBBp. TfR expression was independently associated with improved functional outcomes and neurological scores at three months. These results deciphered the long-debated post-stroke BBB dynamics and established a positive association between TfR overexpression and subacute recovery processes, thus supporting its use as a delivery platform or target.In conclusion, the results obtained through this thesis indicate that TfR concurrent with increased subacute BBBp have a key role in subacute recovery processes after stroke, fostering the development of tailored TfR-mediated therapeutics aiming to promote repair mechanisms, the ultimate unmet need in stroke treatment.

O Acidente Vascular Cerebral (AVC) continua a ser uma das principais causas de mortalidade e morbilidade a nível mundial. As terapêuticas atuais destinam-se a restaurar o fluxo sanguíneo, evitando a lesão isquémica subsequente. Contudo, estas terapias são altamente limitadas pela sua estreita janela terapêutica, instigando o desenvolvimento de novas terapias neuroprotetoras. A barreira hematoencefálica (BHE) constitui o principal obstáculo para o fornecimento de agentes terapêuticos ao cérebro, contudo, esta estrutura biológica expressa um elevado número de recetores de superfície, chave para a sua função fisiológica, que representam também uma plataforma ideal para a administração de fármacos. Para este objetivo, o recetor da transferrina (TfR) é reconhecido como um candidato potencial devido à sua elevada expressão na BHE. Após um AVC, a BHE sofre uma perturbação que evolui de forma dinâmica através de diferentes fases da doença, alterando a expressão de recetores, embora os seus mecanismos exatos não tenham ainda sido decifrados. Em fase de desenvolvimento de vasos cerebrais, verifica-se um aumento do metabolismo de ferro e concomitantemente da expressão do TfR, colocando-se a hipótese de que durante o processo angiogénico na fase subaguda de recuperação após AVC, poder-se-ia igualmente verificar a sobreexpressão do TfR, tornando-se a altura ideal para as terapias neurorestorativas. Neste projeto utilizámos uma abordagem translacional e multidisciplinar para compreender a evolução da permeabilidade da BHE (BHEp) após o AVC e a associação entre a expressão subaguda do TfR e a BHEp, com o objetivo final de identificar uma plataforma terapêutica de entrega melhorada para permitir estratégias de recuperação neuronal.Para clarificar o curso temporal da BHEp durante as fases do AVC, realizámos uma revisão sistemática e meta-análise. Incluímos todas as pesquisas relevantes até 31 de Dezembro de 2021 e calculámos a BHEp como a diferença média padronizada entre os lados ipsilateral e contralateral do cérebro. A expressão da TfR na BHE subaguda foi avaliada através de um estudo prospetivo observacional de doentes entre 18 e 80 anos de idade com AVC isquémico agudo no território da artéria cerebral média. Os doentes foram submetidos a uma avaliação clínica completa no momento da admissão. Todos os doentes foram submetidos a tomografia por emissão de positrões (PET) e ressonância magnética (RM) sete dias após o início do AVC. As imagens foram realizadas subsequentemente no mesmo dia, começando com o PET de 68Ga-citrato para avaliação do TfR. A adequação de 68Ga-citrato como marcador do TfR na BHE foi avaliada primeiro num modelo in vitro humano da BHE. A RM envolveu a utilização de contraste dinâmico para quantificar a BHEp. O TfR foi avaliado semi-quantitativamente através do cálculo do valor de absorção padronizado do citrato de 68Ga-citrato. O seguimento clínico aos três meses incluiu uma RM adicional para avaliar a lesão isquémica, avaliação de resultados funcionais através da escala modificada de Rankin e avaliação neurológica.A meta-análise incluiu 22 estudos e 1592 doentes, documentando um padrão de contínuo aumento da BHEp durante pelo menos 30 dias. O pico de aumento foi documentado entre as fases aguda-subaguda. Esta análise revelou que a extensão da BHEp influencia o resultado clínico do doente dependendo da fase do AVC, sendo a fase subaguda tardia (7-10 dias) chave para um melhor resultado clínico. A população do estudo incluiu 30 doentes; idade mediana de 72.5 (IQR: 64-77) anos. Os nossos resultados indicam que na fase subaguda do AVC há uma sobreexpressão do TfR no cérebro isquémico. Este aumento é concomitante com o aumento da BHEp. A expressão do TfR foi independentemente associada a um melhor resultado funcional e pontuação neurológica aos três meses. Estes resultados clarificaram a dinâmica da BHE pós-AVC e estabeleceram uma associação positiva entre a sobreexpressão da TfR e os processos de recuperação subaguda, apoiando assim a sua utilização como plataforma ou alvo de entrega.Em conclusão, os resultados obtidos através desta tese indicam que o TfR em simultâneo com o aumento da BHEp subaguda tem um papel fundamental nos processos de recuperação subaguda em AVC, promovendo o desenvolvimento de terapêuticas mediadas pelo TfR com o objetivo de promover mecanismos de reparação após o AVC, a principal falha contemporânea no tratamento do AVC.