Evaluation of Therapeutic Interests of Bee Venom from Apis mellifera intermissa as a Bioactive Ingredient in Melanomas

Abstract

The ethnopharmacological data from Morocco show strong traditional use of natural tissue and extracts by our ancestors for preventive and curative purposes, representing a valuable and promising guide for research. Furthermore, natural heritage represents an extreme biodiversity richness in bioactive substances. It is the case, for instance, with bee products such as honey, propolis, bee wax, and bee venom. Manuscripts from pharaonic civilization show that ancient Egyptians mummified their dead with honey and other bee products. In Muslim culture, we can easily notice the part of honey in everyday use, and this is related to a whole chapter of the Holy Qur'an, untitled "the bees" (Surat An'Nahl). Healing by bee stings is well known in Eastern cultures as well as in ancient Europe. In line with this, the current project proposal attempts to highlight and evaluate bee venom as a possible bioactive natural substance and therefore value the product as a drug itself or a therapeutic adjuvant. Thence, we claim that its production is a substantial and strategic challenge of sustainable development. This work's main aim was to study the chemical characterization and evaluate "in fin" the potential value of biological activities, essentially the anticancer activity of Apis mellifera intermissa venom, the main abundant honey bee species in Morocco. This work followed a straightforward procedure that the strategic key is the improvement of a bee venom collector. We applied a patent request for this device. This improvement affects several levels, including the purity of bee venom, the yield of the collection, the beehives' stability in the apiary, and the decrease of bee damage per collection period. Moreover, this collector provides an affordable device for Moroccan beekeepers. Fifteen Apis mellifera venom samples from three regions, Northeastern, Center, and Southern Morocco, were subjected to chemical characterization by LC-ESI/MSn and NIR spectroscopy and metal determination by AAS spectroscopy. Likewise, we evaluated the bee venom's bioactive properties by assessing its cytotoxic activity on different tumoral cell lines and PLP2 cells and evaluating its antiinflammatory activity in RAW264.7 cell lines. LC-ESI/MSn analyses showed that the chemical composition of HBV, mainly the most abundant including melittin, PLA2, and apamin, is notably influenced either by bee environment factors or by collect process conditions. The findings showed no significant differences in mean amounts between or within regions except for PLA2, which is more concentrated in samples from the center and southern region. The data provided by NIR spectroscopy supported this pattern. Heavy metals and micronutrients or trace elements were found in all samples but kept still in the range recommended by guideline references for pharmaceutical raw materials taken into consideration in this investigation (< 5ppm). However, results obtained by AAS spectroscopy revealed that there are, albeit less clear, pollution sources that affected lead concentrations in samples from the northeastern region. We might claim and attribute that to the presence of many coal mines in this region. So, we plan to investigate in this context. NIR and AAS can be highly recommended as two reliable techniques for limit tests and authentication as a pharmaceutical raw. All Apis mellifera intermissa venom samples tested on the six tumor cell lines displayed cytotoxic and anti-inflammatory activities. Only samples from the northeastern with the highest concentration mean values in apamin and PLA2 manifested significant activity on MCF-7, MM127, and RAW264.7 cell lines with the lowest concentrations of GI50. Besides, this is consistent to a large extent with the known anti-inflammatory activity essentially for apamin and partially for melittin in addition to synergistic and complementary cytotoxic properties for melittin and PLA2. Furthermore, the correlation test showed that there was a moderate negative linear relationship, on the one hand between PLA2 and MM127 melanoma cell lines and, on the other hand, between PLA2 and MCF-7 tumor cell lines. Likewise, between PLA2 and RAW264.7 and between apamin and the same cell lines. in light of the previous, Apis mellifera intermissa venom can be considered a source of bioactive components. Its evident cytotoxic activity on MM127 and at a moderate level on MCF-7 make it a potential candidate to fight as an adjuvant or treatment, essentially against melanoma skin cancer and to some degree against human breast cancer. This study, being the first report on Apis mellifera intermissa venom from different regions of Morocco, uncovered this valuable product's chemical and biological properties and constituted an attempt to set up a Good Beekeeping Practices (GAP) procedure for bee venom collection. Thus, this confirms its position as the most prone among the enormous bioactive substances for new apiceuticals discovery for melanomas and other tumors treatment.

Les données ethno-pharmacologiques du Maroc montrent une forte utilisation traditionnelle des tissus et des extraits naturels par nos ancêtres à des fins préventives et curatives, ce qui représente un patrimoine précieux et prometteur pour la recherche scientifique. En effet, ce patrimoine naturel renferme une extrême richesse de la biodiversité en substances bioactives. C'est le cas, par exemple, des produits apicoles tels que le miel, la propolis, la cire et le venin d'abeille. Des manuscrits de l'Égypte ancienne montrent que la momification a été effectuée avec du miel entre autres produits de l'abeille. Dans la culture musulmane, on peut facilement remarquer la part du miel dans l'usage quotidien, en ajoutant bien évidement à tout un chapitre du Saint Coran intitulé "Les abeilles" (Surat An'Nahl). De même, la guérison par les piqûres d'abeilles est bien connue aussi bien dans les cultures orientales ainsi que dans l'Europe ancienne. Dans cette optique, la proposition du présent projet vise à évaluer le venin d'abeille en tant qu’éventuelle substance naturelle bioactive, et à valoriser le produit par la suite, comme adjuvant pharmaceutique et/ou thérapeutique dans le traitement des cancers de la peau particulièrement les mélanomes. Nous prétendons par conséquent que la production de cette substance est un enjeu substantiel et stratégique du développement durable. La caractérisation chimique, la recherche de présence susceptible des métaux lourds et toxiques, ainsi que l'évaluation "in fine" des activités biologiques notamment l'activité anticancéreuse du venin d'Apis mellifera intermissa, la principale sous-espèce d'abeille à miel abondante au Maroc constituaient l’axe forgeant de cette étude. Ce travail a suivi une carte de route spécifique comprenant, le développement et l'amélioration d'un dispositif de collecte du venin d'abeille, soumis à une demande de brevet, avec des qualités requises à plusieurs niveaux; couvrant la pureté du venin d'abeille, le rendement de la collecte, la stabilité de la ruche ainsi que du rucher, la diminution des dommages causés par les abeilles ou la mort des abeilles excitées par période de collecte, en plus, fournir un dispositif abordable pour les apiculteurs marocains. Quinze échantillons de venin d'Apis mellifera intermissa provenant de trois régions, le nord-est, le centre et le sud du Maroc, ont été soumis à une caractérisation chimique par CL-IEP/SMn et par spectroscopie PIR ainsi qu'à la détermination des métaux par spectroscopie SAA. Les propriétés bioactives du venin d'Apis mellifera intermissa ont été évaluées en mesurant son activité cytotoxique sur différentes lignées cellulaires tumorales et sur les cellules PLP2, et en évaluant son activité anti-inflammatoire sur les lignées cellulaires RAW264.7. Les analyses CL-IEP/SMn ont montré que la composition chimique du venin d’abeille, notamment les composants les plus abondants dont la mélittine, le PLA2 et l'apamine, est remarquablement influencée soit par des facteurs liés à l'environnement de l'abeille, soit par des conditions du processus de collecte. Aucune différence significative en quantités moyennes n'a été observée entre les régions ou au sein de celles-ci, à l'exception des quantités en PLA2 qui est plus concentrée dans les échantillons de la région du centre et du sud. Cette tendance est clairement soutenue par les données fournies par la spectroscopie PIR. Les métaux lourds et les micronutriments ont été trouvés dans tous les échantillons mais restent dans les fourchettes recommandées par les références des directives pour les matières premières pharmaceutiques prises en considération dans cette étude (< 5ppm). Cependant, les résultats obtenus par spectroscopie SAA ont révélé qu'il existe des sources de pollution, bien que moins claires, qui ont affecté les concentrations de plomb dans les échantillons de la région nord-est. On pourrait prétendre et attribuer cela à la présence de nombreuses mines de charbon dans cette région. C'est donc dans ce contexte qu'il convient de mener une enquête plus approfondie. La spectroscopie PIR et la spectroscopie SAA peuvent être fortement recommandées comme deux techniques fiables pour les tests limites et pour l'authentification du venin d’abeille en tant que matière première pharmaceutique. Tous les échantillons de venin d'Apis mellifera intermissa testés sur les six lignées cellulaires tumorales ont montré des activités cytotoxiques et anti-inflammatoires, mais seuls les échantillons du nord-est, ayant les valeurs moyennes de concentration les plus élevées en apamine et PLA2, ont montré des activités significatives sur les lignées cellulaires MCF-7, MM127, et RAW264.7 (GI50 et EC50 plus faible). En outre, cela correspond dans une large mesure à l'activité anti-inflammatoire connue essentiellement pour l'apamine et partiellement pour la mélittine, en plus des propriétés cytotoxiques synergiques et complémentaires pour la mélittine et le PLA2. Par ailleurs, les tests de corrélation ont montré qu'il existe une relation linéaire négative modérée, d'une part entre la PLA2 et les lignées cellulaires de mélanome MM127, et d'autre part entre la PLA2 les lignées cellulaires du cancer du sein MCF-7. Le même constat a été observé entre PLA2 et RAW264.7 et entre l'apamine et les mêmes lignées cellulaires. À la lumière de ce qui précède, le venin d'Apis mellifera intermissa peut être considéré comme une mine de composants bioactifs. Son activité cytotoxique évidente sur MM127 et à un niveau modéré sur MCF-7 en font un candidat potentiel pour lutter comme adjuvant et/ou traitement, essentiellement contre le cancer de la peau particulièrement les mélanomes et dans une certaine mesure contre le cancer du sein humain. Cette étude, présentant le premier rapport sur quinze échantillons de venin d'Apis mellifera intermissa provenant de trois régions du Maroc, a non seulement mis en évidence les propriétés chimiques et biologiques de ce précieux produit et de le positionner dans l’énorme arsenal de substances bioactives, comme le candidat le plus susceptible à la découverte de nouvelles apiceuticals, mais a également constitué une tentative réussie de mise en place d’une procédure de bonnes pratiques d’apiculture (BPA) en matière de collecte du venin d’abeille, et donc de valoriser cette substance pour devenir une valeur ajoutée au revenu des apiculteurs et contribuer ainsi au développement durable pour une importante partie de la société.