Study of potential biomarkers for differentiating between benign and malignant thyroid tumors

Abstract

O cancro da tiroide é uma doença endócrina e maligna comum; no entanto o seu diagnóstico não é simples. A norma atual para o diagnóstico do cancro da tiroide é a biópsia aspirativa por agulha fina (do inglês, FNAB), mas quando a análise citológica não fornece resultados diagnósticos ou as amostras pertencem a categorias indeterminadas, os doentes são frequentemente encaminhados para cirurgia diagnóstica. Dado que nem todos esses nódulos requerem remoção, os pacientes não precisariam necessariamente de passar por uma cirurgia se o diagnóstico inicial da FNAB fosse mais conclusivo. Há, portanto, falta de biomarcadores confiáveis e específicos para malignidade do cancro da tiroide, que possam complementar os métodos de diagnóstico atuais.As abordagens “omicas” têm ganho muita atenção na última década no campo da descoberta de biomarcadores para caracterização diagnóstica e prognóstica de várias condições fisiopatológicas. Neste projeto, abordagens de proteómica e metabolómica foram aplicadas em nódulos da tiroide de pacientes com lesões benignas e malignas. Além disso, na tentativa de encontrar biomarcadores em biofluidos, para que não seja necessária remoção cirúrgica ou citologia aspirativa, foram analisadas amostras de urina por dois métodos exploratórios. Por fim, a H₂¹⁸O é apresentada como um novo marcador metabólico para estudar fluxos de glucose, que por sua vez são centrais nas alterações metabólicas de malignidade.Embora a área da metabolómica tenha crescido nos últimos anos, são necessárias melhorias, nomeadamente na identificação de metabolitos, para que esta área esteja bem estabelecida. A ressonância magnética nuclear (RMN) tem sido a técnica mais utilizada para estudos de metabolómica, no entanto, devido à alta sensibilidade da espectrometria de massa, há um grande interesse em aprimorar esta técnica. A principal dificuldade da metabolómica por LC-MS é a identificação de metabolitos com confiança, sendo que esta dificuldade vai cada vez mais sendo superada pela automação na comparação de espectros de fragmentação em bases de dados. Acompanhando essas tentativas de melhorar a identificação de metabolitos, uma biblioteca interna de dados contendo aproximadamente 300 compostos foi construída durante este projeto. Dada a complementaridade das técnicas, tanto a RMN, como a espectrometria de massa foram empregadas na análise metabolómica de tecido, o que permitiu maximizar as informações extraídas destas amostras, bem como auxiliar na identificação de metabolitos e validação de resultados.A análise de tecidos forneceu vários biomarcadores interessantes quer através da proteómica, como da metabolómica. A combinação desses resultados através da mixómica demonstrou a alta exigência energética e de biomassa das células cancerígenas, bem como um painel de biomarcadores incluindo duas features metabólicas identificadas como péptidos livres (520.7993/11.64 - péptido GPPVSELITK de histone H1.4, 560.7719/7.56 - péptido FGGPGTASRPSS de vimentin) e duas proteínas (V-type proton ATPase subunit C 1 e synaptic vesicle membrane protein VAT-1 homolog) com alta sensibilidade e especificidade. Por outro lado, a análise de urina forneceu poucos potenciais biomarcadores, indicando que ainda existe a necessidade em encontrar biomarcadores em biofluidos. Além disso, foram realizadas várias experiências que comprovam a viabilidade da H₂¹⁸O como marcador alternativo para uma análise aprofundada do metabolismo de pacientes com cancro. No seu conjunto, estes resultados contribuíram para aumentar o conhecimento do fenótipo de cancro da tiroide e dos perfis bioquímicos correspondentes, além de fornecer potenciais biomarcadores de malignidade e desta forma melhorar as metodologias de diagnóstico.

Thyroid cancer is a common endocrine malignancy; however, its diagnosis is not straightforward. The current gold standard for diagnosing thyroid cancer is fine needle aspiration biopsy (FNAB), but when cytological analysis does not provide diagnostic results or samples belong to undetermined categories of diagnosis, patients are often referred to diagnostic surgery. Given that not all these nodules require removal, patients would not necessarily require surgery had the initial FNAB diagnosis been more conclusive. There is therefore a lack of reliable and specific biomarkers for thyroid cancer malignancy, that can complement and improve the current diagnosing methods.“Omics” approaches have gained much attention in the last decade in the field of biomarker discovery for diagnostic and prognostic characterization of various pathophysiological conditions. In this project, proteomics and metabolomics approaches were applied in thyroid nodules from patients with benign and malignant lesions. Furthermore, in attempting to find biomarkers in biofluids that do not require surgical removal or aspiration cytology, urine samples were analysed by two exploratory methods. Lastly, H₂¹⁸O is presented as a new metabolic tracer to study glucose fluxes, which are central for malignancy metabolic shifts. Although the metabolomics field has grown in the last years, improvements, namely in metabolite identification, are necessary for the field to be well established. Nuclear magnetic resonance (NMR) has been the most used technique in metabolomics studies, however, due to the high sensitivity of mass spectrometry, there is a high interest in this technique’s improvement. The main difficulty in LC-MS metabolomics is the confident identification of metabolites, which is now being mostly surpassed by automation of fragmentation spectra comparison with databases. Accompanying these attempts at improving metabolite identification, an in-house library database containing approximately 300 compounds has been built during this project. Given the complementarity of the techniques, both NMR and mass spectrometry were deployed for the metabolomics tissue analysis, which maximized the information extracted from these samples, as well as assisted in metabolite identification and result validation.Tissue analysis provided several interesting biomarkers by both proteomics and metabolomics. The combination of these results by a mixomics approach demonstrated the high energetic and biomass demand of cancer cells, as well as a biomarker panel including two metabolic features identified as free peptides (520.7993/11.64 - peptide GPPVSELITK from histone H1.4, 560.7719/7.56 - peptide FGGPGTASRPSS from vimentin) and two proteins (V-type proton ATPase subunit C 1 and synaptic vesicle membrane protein VAT-1 homolog) with high sensitivity and specificity. On the other hand, urine analysis provided few potential biomarkers, indicating that the need for biomarkers from biofluids remains. In addition, several experiments were conducted that prove the viability of H₂¹⁸O as an alternative tracer for an in-depth analysis of the metabolism of cancer patients. Together, these results have contributed to increasing the knowledge of thyroid cancer phenotype and corresponding biochemical profiles, as well as providing potential biomarkers for malignancy, and improving diagnostic methodologies.