Role of osteosarcoma-derived secretome and exosomes in lung metastatic organotropism: from premetastatic niche formation to molecular imaging

Abstract

Pulmonary metastases represent the most adverse clinical factor for osteosarcoma (OS) patients and rank as the leading cause of OS-related death. Nearly 80-90% of the patients diagnosed with localized OS have lung micrometastases that are still subclinical or undetectable at the time of diagnosis using the currently available imaging diagnostic tools. Unfortunately, most of these small unnoticeable lesions are likely to progress into lethal lesions during the disease. Despite aggressive therapeutic approaches, including pulmonary metastasectomy followed by chemotherapy, metastatic or recurrent OS’ prognosis is poor, with an overall 5-year survival rate of only about 20%, and no significant improvement in the survival rate has been achieved over the past 30 years. Early diagnostic and more effective therapeutic strategies for lung metastasis are urgently needed to overcome this dismal scenario. Primary tumours prepare in advance a supportive premetastatic niche (PMN) in distant specific secondary organs for the formation of metastases. Therapeutic strategies targeting the PMN offer an opportunity to prevent or suppress metastases development. Despite advances on this topic, sarcomas have been less studied, and the mechanisms enabling the development of organotropic lung metastases are not clearly understood.In this thesis, we investigated the cellular and molecular mechanisms underlying the formation of organotropic lung metastases in OS to identify potential mechanistic pathways for therapeutic intervention and prognostic biomarkers. We have also developed an imaging tool based on OS cell-derived exosomes (EXs) as targeted diagnostic imaging agents for the early and non-invasive assessment of lung micrometastasis by positron emission tomography (PET).In the first part, described in chapter 2, we evaluated how primary OS reprograms the lung microenvironment to establish a PMN for metastatic outgrowth, using two experimental mouse models and a multi-omics approach. We discovered that metastatic OS cells secrete a wide range of biomolecules that induce a supportive and permissive PMN in the lung for incoming tumour cells, including ECM remodelling, stromal fibroblast activation, neutrophil mobilization, and the generation of an inflammatory microenvironment, which is supported by transcriptomic and histological data. These systemic-induced microenvironmental changes promoted and accelerated the development of organotropic lung metastases either in experimental or spontaneous lung metastatic mouse models. Furthermore, the comparative proteomic analysis of the different secreted proteins identified in the secretome of metastatic OS cells and the plasma samples from primary tumour-bearing mice allowed us to identify EFEMP1 as a potential prognostic biomarker of pulmonary metastasis in OS patients.In the second part, described in chapter 3, we explored the innate homing ability of EXs for tumour donor cells and used them as a diagnostic imaging tool for the early detection of small pulmonary metastases. The EXs were functionalized with the bifunctional macrocyclic chelator NODAGA and radiolabelled with the positron-emitter radionuclide copper-64 (64Cu), which endowed them with favourable in vivo behaviour without interfering with their natural organotropism for donor cells. Whole-body PET/Magnetic resonance imaging (MRI) images in xenografted models showed a specific accumulation of 64Cu-NODAGA-EXs in metastatic lesions as small as 2-3 mm or in a primary tumour, demonstrating the exquisite tropism of EXs for homotypic donor cells. The targetability for lung metastasis was also observed by optical imaging using indocyanine green-labelled EXs and D-luciferin-loaded EXs. The intrinsic advantages of EXs as endogenous nanocarriers, featuring excellent biocompatibility and low immunogenicity, and their easy functionalization and radiolabelling make them a highly efficient imaging tool for the detection of homologous lung metastatic lesions by PET. This represents a step forward in the biomedical application of EXs in imaging diagnosis with increased translational potential. In summary, our results provide valuable insights into the cellular and molecular mechanisms underlying lung alterations induced by OS cell-derived factors during the PMN formation and metastatic process. Interfering with these biological processes may prevent or delay lung metastasis development, thus contributing to a better prognosis for these patients. The identification of EFEMP1 as a potential biomarker with added value for the risk of lung metastases is of utmost clinical importance to select patients for close surveillance and early therapeutic intervention. Lastly, the EX-based imaging tool can improve the early detection of lung metastases by PET and contribute to the development of a new generation of diagnostic agents, in the context of personalized medicine.

O desenvolvimento de metástases pulmonares é atualmente a principal causa de morte dos doentes com osteossarcoma (OS). Cerca de 80-90% dos doentes com OS localizado apresenta micrometástases pulmonares aquando do diagnóstico, que na sua maioria não são detetadas pelas técnicas de imagem convencionais, e que acabam por progredir para lesões letais durante o curso da doença. Apesar das abordagens terapêuticas agressivas, incluindo metastasesectomia pulmonar e quimioterapia, o prognóstico do OS metastático tem uma taxa de sobrevivência global aos 5 anos de apenas de 20%, a qual não tem evoluído significativamente nos últimos 30 anos. Um diagnóstico mais precoce e terapias mais eficazes são urgentes para reverter este cenário adverso. Sabe-se que os tumores primários preparam com antecedência um nicho pré-metastático (PMN, do inglês premetastatic niche) de suporte em órgãos secundários específicos, propícios à formação das metástases. Estratégias terapêuticas que interfiram com a formação desse nicho oferecem uma oportunidade para prevenir ou retardar a formação de metástases. Apesar dos avanços na área, os sarcomas têm sido pouco estudados, e permanecem por esclarecer os mecanismos que favorecem a colonização e formação de metástases no pulmão. Nesta tese, explorámos os mecanismos celulares e moleculares que estão subjacentes à formação de metástases pulmonares para identificar potenciais novos alvos terapêuticos e biomarcadores de prognóstico. Desenvolvemos igualmente uma ferramenta de diagnóstico baseada em exossomas (EXs) derivados de células de OS, para a deteção de micrometástases pulmonares por tomografia por emissão de positrões (PET, do inglês positron emission tomography).Na primeira parte, descrita no capítulo 2, avaliámos de que forma o OS primário reprograma o microambiente pulmonar de forma a favorecer a formação de metástases, utilizando dois modelos animais e uma abordagem multiómica. Verificámos que as células tumorais secretam uma vasta gama de biomoléculas que induzem alterações no microambiente pulmonar, incluindo a remodelação da matriz extracelular, a ativação de fibroblastos, recrutamento de neutrófilos e resposta inflamatória, suportado por dados histológicos e de transcriptómica. Este efeito sistémico dos fatores secretados pelas células tumorais no microambiente promoveu e acelerou o desenvolvimento de metástases pulmonares, quer no modelo experimental de metástases pulmonares quer no modelo espontâneo. Além disso, a análise proteómica comparativa do secretoma das células tumorais e do plasma de murganhos com tumor primário resultou na identificação da EFEMP1 como um potencial biomarcador de prognóstico de metástases pulmonares em doentes com OS. Na segunda parte, descrita no capítulo 3, tirando partido da afinidade inata dos EXs pelas células tumorais que os produziram, explorámos o seu potencial como agentes de imagem para o diagnóstico precoce de pequenas metástases pulmonares. Os EXs foram funcionalizados com um agente quelante macrocíclico bifuncional NODAGA e radiomarcados com o radionuclídeo emissor de positrões cobre-64 (64Cu), o que lhes conferiu uma farmacocinética favorável, sem interferir com o seu tropismo intrínseco para as células parentais. As imagens de PET e de imagiologia por ressonância magnética dos modelos animais mostraram uma acumulação específica de 64Cu-NODAGA-EXs em lesões metastáticas com 2-3 mm e também no tumor primário, demonstrando a excelente especificidade dos EXs para células tumorais homotípicas. Esta afinidade dos EXs pelas metástases pulmonares foi também observada por imagiologia ótica, utilizando EXs marcados com verde de indocianina e carregados com D-luciferina. As vantagens intrínsecas dos EXs como nanotransportadores endógenos, nomeadamente a excelente biocompatibilidade e baixa imunogenicidade, e a sua fácil funcionalização e radiomarcação fazem deles uma ferramenta de imagem altamente eficaz na deteção de metástases pulmonares por PET. Esta descoberta representa um avanço na aplicação biomédica de EXs no diagnóstico por imagem e com um grande potencial translacional. Em resumo, os nossos resultados contribuíram para uma melhor compreensão dos mecanismos que precedem a formação de metástases durante a formação do PMN, e permitiram identificar possíveis vias mecanísticas para intervenção terapêutica de forma a prevenir ou retardar o desenvolvimento de lesões pulmonares, contribuindo assim para uma melhoria da sobrevida destes doentes. A identificação da EFEMP1, como um potencial biomarcador para o risco de metástase pulmonar, é de grande importância uma vez que poderá permitir vigilâncias e intervenções terapêuticas mais atempadas. Por fim, a PET com EXs radiomarcados pode permitir um diagnóstico precoce de metástases pulmonares e contribuir para o desenvolvimento de uma nova geração de agentes de diagnóstico no contexto da medicina personalizada.