mitoBone: Mitochondrial performance on osteoclast differentiation and function during E2 deprivation - Finding new targets for osteoporosis treatment

Abstract

Redução dos níveis de estrogénio após menopausa aumenta a reabsorção óssea, o que contribui para o desenvolvimento de osteoporose. O estrogénio protege contra a perda de massa óssea ao diminuir o número de osteoclastos e ao inibir a reabsorção do osso. Este efeito é devido, pelo menos em parte, a efeitos diretos nos osteoclastos. Os osteoclastos são células de grandes dimensões e multinucleadas, especializadas na reabsorção óssea. A citocina RANKL indispensável no seu processo de diferenciação. Porém, os mecanismos moleculares responsáveis pela acção dos estrogénios nos osteoclastos não são conhecidos. Estudos iniciais realizados por nós demonstraram que o 17β-estradiol (E2) diminui o número de osteoclastos, ao promover a apoptose dos seus progenitores, e não de osteoclastos completamente diferenciados. Este efeito apoptótico do E2 foi eliminado em células que não contêm Bax/Bak, duas proteínas necessárias para a ativação da apoptose mediada por mitocôndria. Fizemos também uma análise de microarrays que mostrou que a sinalização do estrogénio através do ERα, em precursores dos osteoclastos, diminui a expressão de genes associados ao complexo I da cadeia respiratória mitocondrial. Além disso, o E2 diminuiu a atividade do complexo I e a taxa de consumo de oxigénio da mitocôndria. Estas descobertas indicam que a modulação da função mitocondrial é um mediador importante dos efeitos inibitórios dos estrogénios nos osteoclastos. De acordo com estes dados iniciais, a hipótese nesta dissertação é que os estrogénios diminuem o número de osteoclastos e a reabsorção óssea ao inibir a estimulação do complexo I pelo RANKL e ao promover a apoptose mediada pela mitocôndria. Baseados no nosso estudo inicial, começámos por definir um perfil metabólico detalhado. Usámos dois modelos biológicos – a linha celular de macrófagos RAW 264.7 e os macrófagos derivados da medula óssea (bone marrow-derived macrophages, BMMs). A incubação destas células com RANKL estimulou o metabolismo mitocondrial, enquanto o E2 inibiu estes efeitos e promoveu a apoptose. Surpreendentemente, os efeitos pro-apoptóticos do E2 foram associados à acumulação na mitocôndria da proteína fosforilada p392S-p53. Estes dados descrevem os efeitos iniciais do RANKL no metabolismo dos precursores dos osteoclastos e sugerem, pela primeira vez, um mecanismo de apoptose associado à p53, que pode contribuir para os efeitos protetores do E2, contra o desenvolvimento de osteoporose. Em seguida, focámo-nos no mecanismo responsável pelas ações do RANKL e dos estrogénios no complexo I. Examinámos se a proteína ECSIT, uma proteína associada ao complexo I, poderia estar implicada nos efeitos do RANKL e do E2. Descobrimos que o RANKL promove a interação entre a ECSIT e a TRAF6 (uma proteína associada à sinalização do RANKL) e que aumenta os níveis de ECSIT na mitocôndria. De seguida, silenciámos a proteína ECSIT. As células silenciadas não se conseguiram diferenciar em osteoclastos e os efeitos estimulatórios do RANKL e os efeitos inibitórios do E2 na mitocôndria também não foram verificados. Além disso, o RANKL promoveu a morte celular destas células. Estes resultados sugerem que a proteína ECSIT contribui para os efeitos estimulatórios do RANKL e que a inibição da translocação da ECSIT para a mitocôndria pode contribuir para as ações inibitórias do estrogénio. A disfunção do complexo I que observámos nas células silenciadas foi associada também com uma alteração no balanço redox (rácio NAD+/NADH) das células. A partir de análise de microarrays, verificámos que a sinalização do estrogénio através do ERα diminui a expressão de genes associados à NAD salvage pathway. Dado que tínhamos verificado anteriormente que a enzima Sirt3 (uma desacetilase mitocondrial dependente de NAD+) era necessária para o aumento da reabsorção óssea causada pela diminuição dos níveis de estrogénio, levou-nos a estudar o efeito dos níveis de NAD+ na acção do RANKL e estrogénio. A estimulação das BMMs com RANKL aumentou o rácio NAD+/NADH e a atividade da Sirt3. O E2 inibiu estes efeitos. De seguida, adicionámos um precursor do NAD, que restaurou o rácio NAD+/NADH enquanto a adição de Fk866, que inibe especificamente a enzima Nampt, diminuiu os níveis de NAD e mimetizou os efeitos do E2. Para verificar estes efeitos in vivo, desenvolvemos dois modelo animais com uma deleção da Sirt3 ou do NAMPT, em células da linha hematopoética. Estes animais apresentavam uma atenuação da perda de massa óssea após ovariectomia. Os resultados obtidos nesta dissertação demonstraram, pela primeira vez, a mitocôndria como nódulo central dos efeitos do estrogénio a nível de diminuição do número e atividade dos osteoclastos. Mostrámos que os efeitos estimulatórios iniciais do RANKL atuam especificamente no complexo I e no balanço redox da célula. Um conhecimento mais alargado deste mecanismo pode levar ao desenvolvimento de novos tratamentos que diminuam o risco de fraturas ósseas em mulheres pós-menopausa.

Estrogen deficiency increases bone resorption, contributing to osteoporosis development Estrogens protect against bone loss by decreasing osteoclast number and inhibiting bone resorption via, at least in part, direct effects on osteoclasts. Osteoclasts are giant multinucleated cells that are specialized in bone resorption. The differentiation process requires the indispensable action of the cytokine RANKL. However, the molecular mechanisms mediating the effects of estrogen on osteoclasts remain unclear. Initial studies from us showed that 17β-estradiol (E2) decreased osteoclast number by promoting the apoptosis of early osteoclast progenitors, but not mature osteoclasts. The apoptotic effect of E2 was abrogated in cells lacking Bak/Bax, two proteins required for mitochondrial apoptotic death. Moreover, using microarray analysis, we have elucidated that ERα-mediated signaling in osteoclast progenitors decreases the expression of mitochondria complex I genes. Additionally, E2 decreased the activity of complex I and oxygen consumption rate in bone-marrow macrophages (BMMs) after 48 hours. These findings indicate that modulation of mitochondria function is an important mediator of the antiosteoclastogenic effects of estrogens. Given these initial results and driven by the necessity of develop new therapies that allow a better adherence, we hypothesize that estrogens reduce osteoclast number and bone resorption by inhibiting RANKL stimulation of complex I and promoting mitochondria-mediated apoptosis. Based on our initial study, we aimed to give a detailed metabolic fingerprinting of osteoclast precursors. We used two different biological models, RAW 264.7 macrophage cell line and BMMs, and found that RANKL stimulated the mitochondrial metabolism, while E2 inhibited. E2 also decreased cell number and stimulated the mitochondrial-mediated apoptotic pathway. Surprisingly, the pro-apoptotic effects of E2 were associated with the accumulation of p392S-p53 in mitochondria. These findings elucidate the early effects of RANKL on osteoclast progenitor metabolism and suggest novel p53-mediated mechanisms that might contribute to the protective effects of E2.We then focused on the mechanisms responsible for the actions of RANKL and estrogens on mitochondrial complex I. We examine whether ECSIT, a complex I-associated protein, could be implicated in the rapid effects of RANKL and E2 on osteoclast progenitors. We found that RANKL promoted ECSIT-TRAF6 (essential adaptor protein for RANKL signalling) interaction and increased the levels of ECSIT in mitochondria after 6 hours incubation while E2 abrogated these effects. We then silenced ECSIT, using shRNA, and found that lack of ECSIT decreased osteoclast differentiation and abrogated the inhibitory effects of E2 on osteoclastogenesis. Loss of ECSIT also decreased complex I activity. In the absence of ECSIT, the stimulatory actions of RANKL and inhibitory actions of E2 were prevented. Instead, RANKL stimulated apoptosis of osteoclast progenitors. Overall, our results indicate that ECSIT is important for the early effects of RANKL on mitochondria and that inhibition of ECSIT-mediated mitochondria stimulation might contribute to the bone protective actions of estrogens.The complex I dysfunction that we observed in ECSIT-silenced cells was associated with an alteration in the NAD+/NADH redox balance of the cells. Using microarray analysis, we showed that ERα-mediated signaling in osteoclast progenitors decreases the expression of genes associated with the NAD salvage pathway. This, together with our previous finding that NAD+-dependent mitochondria deacetylase Sirt3 is required for the increase in bone resorption caused by estrogen deficiency, led us to study the contribution of NAD+ levels to osteoclastogenesis. The addition of RANKL promoted an increase in NAD+/NADH ratio and increased Sirt3 activity. E2 inhibited these effects of RANKL. The addition of the NAD precursor, nicotinamide riboside (NR), restored the NAD+/NADH ratio and abrogated the inhibitory effects of E2 while the addition of FK866, a specific Nampt inhibitor, decreased NAD levels and mimicked the effect of E2.. To assess these effects in vivo, we evaluated the effect of conditional deletion of Sirt3 or Nampt in cells of the hematopoietic lineage. We found that deletion of either of these proteins attenuated bone loss caused by estrogen deficiency.Overall, the work in this dissertation show, for the first time, mitochondria as a central node for the effects of both RANKL and estrogens. We propose here a new molecular mechanism responsible for the direct inhibitory effects of estrogens on osteoclasts, based on mitochondrial complex I and redox balance. A more complete understanding of this mechanisms might lead to novel therapies to decrease fracture incidence in high-risk post-menopausal women.