Transferência horizontal de genes de resistência à colistina em Salmonella enterica e Escherichia coli de animais produtores de alimentos

Abstract

O uso inadequado e sistemático de antibióticos é uma das principais causas para a emergência da resistência antimicrobiana. O seu uso em animais produtores de alimento promove a seleção de estirpes resistentes com potencial zoonótico, nomeadamente Escherichia coli e Salmonella enterica. A falta de antibióticos eficazes para o tratamento de infeções causadas por bactérias de Gram-negativo multirresistentes, levou à reintrodução da colistina como uma das opções terapêuticas de último recurso. Numerosos estudos relataram a presença de alelos de um gene capaz de conferir resistência à colistina – gene mcr, em plasmídeos, principalmente em E. coli e S. enterica de origem animal. Assim, o objetivo deste trabalho foi compreender de que forma a administração de colistina após o nascimento de animais produtores de alimento pode influenciar a resistência de E. coli presente na sua microbiota intestinal, e se essa resistência e estirpes se mantêm durante o processo de crescimento até ao abate para consumo humano. Além disso, pretendeu-se, também, avaliar não só o potencial desses genes se moverem horizontalmente entre espécies bacterianas através de conjugação e transformação natural, mas também a virulência e o custo biológico conferido pela aquisição de plasmídeos contendo o gene mcr-1.Começámos por realizar um estudo longitudinal em porcas e seus leitões desde o nascimento até ao abate com foco na caracterização dos genes de beta-lactamases de espectro alargado (ESBL) e mcr, características de virulência e relação genética. Um total de 293 isolados de E. coli foram isolados a partir de amostras fecais obtidas em cinco momentos de amostragem, verificando-se a manutenção de isolados geneticamente relacionados durante as diferentes fases da vida dos leitões. , À nascença, os genes blaCTX-M foram detetados em isolados de E. coli de 9 porcas e 49 leitões (73,41%), e nos quatro momentos seguintes de amostragem este gene foi detetado em 91,8%, 57,6%, 71,4% e 97,4% dos leitões. Similarmente, à nascença, o gene mcr-1 foi detetado em E. coli de uma porca e de três leitões de diferentes ninhadas, em 68,85%, 100%, 90% e 8,1% dos leitões nos restantes momentos. Um novo alelo do gene mcr-4, mcr-4.7, foi identificado em 3,28%, 28,57%, 7,5% dos isolados de E. coli, mas não detetado no último momento de amostragem, verificando-se a sua coocorrência com os genes blaCTX-M e mcr-1em 96,7% e 93,33% dos isolados, respetivamente. Posteriormente, foi avaliada a prevalência, a capacidade de produção de biofilme e o custo biológico da aquisição dos genes mcr e ESBL em 98 isolados de E. coli e 142 de S. enterica. Os genes mcr-1 a -10 foram pesquisados por PCR e, apenas o gene mcr-1 foi identificado em 15,3% dos isolados de E. coli, verificando-se a coexistência de blaTEM-1, blaCTX-M-1 e blaCTX-M-15 em quatro isolados. As concentrações mínimas inibitórias para a colistina foram determinadas pelo método de microdiluição em caldo, de onde se obtiveram valores entre 8 e 32 mg/L. Os plasmídeos IncHI2, IncHII, IncP, IncN e IncI foram não só transferidos por conjugação para E. coli J53, mas também, em alguns casos, por transformação natural para Acinetobacter baylyi BD413. Além disso, o gene blaOXY-2, frequentemente detetado no cromossoma de Klebsiella oxytoca, foi identificado num plasmídeo de E. coli ST162, o qual foi, também, transferido com sucesso para E. coli J53. Relativamente ao custo biológico, verificou-se que quando comparadas, as taxas específicas de crescimento dos transconjugantes eram significativamente menores que as da célula recetora (p<0,05) e que a taxa média de crescimento dos transconjugantes foi maior na ausência de colistina do que na sua presença (1,66 versus 1,32 (p=0,0003)). A estabilidade dos plasmídeos adquiridos por conjugação foi avaliada através de transferências sucessivas em meio de cultura sem colistina, verificando-se que a taxa de retenção do plasmídeo variou desde a sua perda completa até à sua retenção total.A capacidade de formação de biofilme foi avaliada através do ensaio do cristal violeta, em bactérias isogénicas: E. coli J53 e seus transconjugantes, verificando-se que a aquisição do plasmídeo contendo o gene mcr aumenta a quantidade de biofilme produzido. Em conclusão, este estudo destaca a necessidade de reduzir ou de encontrar alternativas ao uso de antibióticos, como a colistina, em sistemas de produção animal, pois as estirpes resistentes são capazes de se manter ao longo das diferentes fases do ciclo de vida dos animais, podendo atingir a cadeia alimentar. Uma vez que a aquisição de genes mcr-1 impõe custo biológico para o hospedeiro, e porque a perda de plasmídeos mostrou ser altamente variável, é possível que outros fatores além da pressão seletiva exercida pelo uso de colistina regulem a manutenção do plasmídeo numa população bacteriana, sugerindo que a sua retirada da produção animal não se traduzirá na reversão completa da resistência à colistina através da diminuição dos níveis de mcr-1.

The inappropriate and systematic use of antibiotics is considered one of the main causes for the emergence of antimicrobial resistance. The use of antibiotics in food-producing animals promotes the selection of resistant strains with zoonotic potential, namely Escherichia coli and Salmonella enterica. The lack of effective antibiotics for the treatment of infections caused by multidrug resistant Gram-negative bacteria, led to the reintroduction of colistin, as one of the last resort therapeutic options. Numerous studies have reported the presence of alleles of one gene capable of conferring resistance to colistin - mcr gene in plasmids mainly from E. coli and S. enterica. Hence, the goals of this study were to understand how the administration of colistin after the birth of food-producing animals, can influence the resistance of E. coli present in their intestinal microbiota, and whether the resistance and strains are maintained during the growth process to slaughter for human consumption. Furthermore, it was also intended to evaluate not only the potential for such genes to move horizontally between bacterial species through conjugation and natural transformation but also the virulence and biological cost conferred by the acquisition of plasmids containing the mcr-1 gene.We have started by conducting a longitudinal study in sows and their piglets in a farrow-to-finish operation, with a focus on the characterization of Extended Spectrum Beta-Lactamases (ESBL) and mcr genes, assessment of virulence traits and genetic relatedness. A total of 293 E. coli isolates were isolated from faecal samples collected in five sampling moments, having verified the maintenance of genetically related isolates during the different phases of the piglets' life. At birth, blaCTX-M genes were detected in E. coli isolates from 9 sows and 49 piglets (73.41%), while in the following four sampling moments this gene was detected in 91.8%, 57.6%, 71.4% and 97.4% of the piglets. Similarly, at birth, the mcr-1 gene was detected in E. coli from one sow and three piglets from different litters, and in 68.85%, 100%, 90% and 8.1% of the piglets, at the remaining ensuing time points of sampling. A new allele of the mcr-4 gene, mcr-4.7, was identified in 3.28%, 28.57%, 7.5% of E. coli isolates, but not detected at the last sampling moment, its co-occurrence being observed with the genes blaCTX-M and mcr-1 in 96.7% and 93.33% of the isolates, respectively.Subsequently the prevalence, biofilm formation ability and biological cost of acquiring mcr and ESBL genes were assessed in 98 E. coli and 142 S. enterica isolates. The mcr-1 to mcr-10 genes were screened via PCR and only mcr-1 gene was identified in 15.3% of the E. coli isolates. The coexistence of blaTEM-1, blaCTX-M-1 and blaCTX-M-15 in four isolates was verified. The minimal inhibitory concentrations for colistin were determined by the broth microdilution method, from which values between 8 and 32 mg/L were obtained. The IncHI2, IncHII, IncP, IncN and IncI plasmids were not only transferred by conjugation into E. coli J53, but also, in some cases, by natural transformation into Acinetobacter baylyi BD413. Furthermore, the blaOXY-2 gene, frequently detected in the Klebsiella oxytoca chromosome, was identified in an E. coli ST162 plasmid, which was also successfully transferred into E. coli J53.In regard to the biological cost, on one hand, it has been detected that when compared, the growth rates of the transconjugants were significantly lower than the recipient cell (p<0.05) whilst on the other hand, the average growth rate of the transconjugants was higher in the absence of colistin than in its presence (1.66 versus 1.32 (p=0.0003)). In addition, the stability of the plasmids acquired by conjugation was evaluated, through consecutive transfers in a culture medium without colistin. It was verified, that the plasmid retention rate ranged from complete loss to full retention.The biofilm formation ability was evaluated, via a crystal violet assay in isogenic bacteria: E. coli J53 and its transconjugants, noting that the acquisition of the mcr-harbouring plasmid increases the amount of produced biofilm.In conclusion, this study highlights a need to reduce or find alternatives to the use of antibiotics, such as colistin, in animal production systems. Since resistant strains are able to maintain themselves throughout the different stages of the food-producing animal's life cycle, and reaching the human food chain. As the acquisition of mcr-1 genes imposes a biological cost on the host and, because the loss of plasmids has been shown to be highly variable, it is possible that factors other than the selective pressure exerted by the use of colistin, regulate the maintenance of the plasmid in a bacterial population. This suggests that colistin withdrawal of from animal production, by lowering mcr-1 levels, will not lead into a complete reversal of colistin resistance.