Enzymatic synthesis of amphiphilic polymer-drug conjugates for cancer treatment

Abstract

O cancro é a segunda maior causa de morte no mundo. Apesar de esforços intensivos, o número de fármacos ativos contra o cancro é ainda relativamente baixo. Os sistemas de libertação controlada de fármacos baseados em nanopartículas podem ultrapassar as desvantagens intrínsecas dos fármacos administrados na forma “livre” (p.e., toxicidade dose-limite, baixa solubilidade, curto tempo de circulação no organismo e multi-resistência). Contudo a sua rápida libertação no organismo continua a ser a principal limitação. Micelas de fármacos covalentemente conjugados com copolímeros podem proporcionar uma entrega controlada, mas a sua síntese é extremamente complicada. Neste sentido, pretendemos abordar a síntese através de uma via enzimática. A Carboxilesterase humana 2 foi estudada pela sua super-expressão em algumas linhas celulares cancerígenas. A degradação seletiva de prodrogas (como por exemplo drogas covalentemente ligadas a copolímeros) nestas células é expectável porque em células normais foi observado uma sub-expressão desta enzima. A validação do modelo foi efetuada através do estudo de mecânica quântica/mecânica molecular da hidrólise da (-)-cocaína por esta enzima. A barreira calculada e determinada experimentalmente (19.7 kcal/mol) estavam em excelente concordância. Posteriormente, avaliámos a aceitação e degradação de trinta conjugados compostos por um fármaco – gemcitabina, SN38, doxorrubicina e paclitaxel – acoplado a um modelo polimérico. Além disso, também foi abordado os perfis de libertação do modelo polimérico calculando a sua libertação do centro ativo da enzima. Seis dos conjugados testados foram capazes de serem hidrolisados pela enzima em estudo. O fármaco SN38 conjugado com poli(ε-caprolactona) e poli(ácido glicólico) foram os sistemas melhor classificados que foram posteriormente seleccionados para conjugação. A lipase B da Pseudozyma (Candida) antarctica foi empregue como catalisador. As barreiras obtidas para a esterificação enzimática de 6-quinolol (modelo do SN38) com poli(ε-caprolactona) indicam que o processo não é viável. No entanto, a esterificação do álcool vanílico e 2-feniletanol foi possível de acordo com as previsões in silico. Estas reacções foram testadas no laboratório e estudadas várias condições para a esterificação e abertura de anel. Testámos a esterificação de um modelo simples de poli(ε-caprolactona) e depois aumentámos a complexidade com a abertura de anel da ε-caprolactona. Conseguimos gerar o poliéster conjugado com álcool vanílico e 2-feniletanol através de um processo enzimático, mas de acordo com as previsões computacionais, não foi possível gerar o derivado com 6-quinolol por via enzimática mas sim por catálise metálica com trióxido de antinómio. Nos conjugados sintetizados, foi obtido um peso molecular que varia de 540-3200 g/mol com rendimentos de isolamento entre 6.0 e 68.4%. Com o aumento de conjugados viáveis fármaco-polímero e abordando a sua síntese, pretendemos contribuir para a resolução de um dos problemas de saúde mais urgentes da sociedade actual: assegurar tratamento eficaz contra o cancro, reduzindo os efeitos secundários que são consequência do modo de administração e formulação de fármacos, promovendo saúde e bem-estar para todos.

Cancer is the second leading cause of death in the world. Despite intensive efforts, the number of effective anticancer drug treatments is relatively low. Nanoparticle-based drug delivery systems can overcome the inherent drawbacks of free drugs, such as dose-limiting toxicity, poor solubility, short biological half-life, and multidrug resistance. However, burst release is still the main limitation. Micelles of drugs covalently conjugated with copolymers can provide a sustained drug release. Nevertheless, their synthesis is a strenuous task which we aim to address with an enzymatic approach. In this thesis, we have studied the human Carboxylesterase 2 enzyme because it is overexpressed in some cancer cell lines. A selective degradation of prodrugs (such as drugs covalently conjugated with copolymers) inside these cells could be expected as a normal expression was observed in normal ones. The benchmark Quantum Mechanics/Molecular Mechanics study was the hydrolysis of (-)-cocaine. The calculated barrier was in excellent agreement with the reported experimental one of 19.7 kcal/mol. We then screened human Carboxylesterase 2 to accept and degrade thirty designed conjugates composed by the drugs – gemcitabine, SN38, doxorubicin and paclitaxel – coupled with a polymer model. Moreover, the profiles for the polymeric model release were also addressed by scanning their release from the enzyme’s active site. From these, six conjugates were predicted to be hydrolysed by the enzyme under study. The SN38 drug conjugated with poly(ε-caprolactone) and poly(glycolic acid) were the best-ranked systems that were latter screened for conjugation. The Pseudozyma (Candida) antarctica lipase B was employed as catalyst. The predicted high-barriers for the enzymatic esterification of 6-quinolol (SN38 model) indicate that the process is not viable. However, the esterification of vanillyl alcohol and 2-phenylethanol was possible according to the in silico predictions. These reactions were tested in the lab and several conditions for the esterification and ring-opening were studied. We tested the esterification of a simple model of poly(ε-caprolactone) and then increased the complexity with ring-opening of ε-caprolactone. We were able to generate the end-capped polyester with vanillyl alcohol and 2-phenylethanol through an enzymatic process, but in accordance with the computational predictions, we were not able to generate the 6-quinolol end-capped derivative through an enzymatic approach and antinomy trioxide was used as catalyst. In the synthesised end-capped poly(ε-caprolactone), we were able to achieve a molecular weight that varies from 540-3200 g/mol with isolation yields from 6.0 to 68.4%. By expanding the scope of viable polymer-drug conjugates and their synthesis, we are contributing to the solution of one of the most urgent health issues of today's society, that is to ensure effective cancer treatments while lowering side effects that are a consequence of the administration mode, formulation, and status of the drugs, self-guarding healthy lives and promoting well-being for all.