Toxicological and mechanistic evaluation behind Montelukast repurposing: metabolomic and proteomic approaches

Abstract

De acordo com a Organização Mundial da Saúde, estima-se que existam cerca de 262 milhões de pessoas diagnosticadas com asma no mundo. É esperado que este número possa aumentar devido a fatores ambientais associados com o desenvolvimento desta patologia, incluindo o tabaco, a poluição e agentes alergénicos. Sem tratamento disponível, o montelucaste (MTK) – um antagonista do receptor 1 dos leucotrienos – é usado por adultos e crianças para controlar os sintomas desta doença. Foram recentemente identificados novos receptores para o MTK, o que contribuiu para propostas de reposicionamento do fármaco como anti-inflamatório no sistema nervoso central, permitindo que seja explorado no tratamento de doenças neurodegenerativas, tais como a doença de Alzheimer e a doença de Parkinson. Contudo, o MTK tem sido associado a um número crescente de efeitos neuropsiquiátricos adversos, principalmente em crianças, tais como agitação, ansiedade, depressão, insónias, e tentativas de suicídio. Além disso, e apesar de ser comercializado desde 1998, o metabolismo deste fármaco continua pouco explorado e os mecanismos subjacentes às reações neuropsiquiátricas adversas continuam desconhecidos. O objectivo deste trabalho consistiu no estudo in vitro e in vivo do metabolismo do MTK, assim como na elucidação das vias metabólicas e proteómicas afetadas, a fim de explicar os seus efeitos tóxicos e analisar o seu potencial reposicionamento terapêutico. Para o estudo do MTK usaram-se sistemas in vitro tais como enzimas isoladas, frações celulares e uma cultura primária de neurónios obtidos a partir de embriões de galinha, assim como um modelo in vivo. Um grupo de murganhos jovens e saudáveis foi tratado diariamente por via oral com 1 mg/kg de MTK, durante uma semana, e tecidos e fluidos foram recolhidos para posterior extração de metabolitos e proteinas. As amostras foram depois analisadas por cromatografia liquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massa de alta resolução com ionização por electrospray, seguida de tratamento de dados e uma abordagem bioinformática com recurso a programas como XCMS, MetaboAnalyst e MaxQuant. Os estudos de metabolismo permitiram identificar 18 novos metabolitos de MTK: 9 de fase I e 9 de fase II. Destes, um deles suscitou particular atenção devido ao seu potencial tóxico: um conjugado MTK-glutationa. Este metabolito estava presente em amostras de cérebro e a sua produção ocorreu também in vitro, tanto na presença como na ausência de catalisadores. Paralelamente, a diminuição dos níveis de glutationa foi confirmada nos resultados da análise metabolómica, o que sugere que este metabolito poderá contribuir para a desregulação das vias de neuro-sinalização. O uso de ferramentas de metabolómica para identificar os metabolitos endógenos cujos níveis foram alterados pelo MTK mostrou também que o MTK tem a capacidade de desregular o eixo hipotálamo-pituitária-hipófise através do aumento dos níveis de corticosterona. A hiper-ativação deste eixo, juntamente com a desregulação de outros neurotransmissores e neuroesteróides, e o aumento do stress oxidativo poderão estar envolvidos nas reações neuropsiquiátricas adversas reportadas. O estudo do proteoma reforçou as conclusões obtidas a partir da análise metabolómica, e mostrou ainda que existe alteração dos níveis de proteínas envolvidas em processos como distúrbios do sono e resposta ao stress. Compilando todos os resultados obtidos, a causa mais provável para a ocorrência de reações neuropsiquiátricas será o estado de maturação do cérebro das crianças. A imaturidade do desenvimento do cérebro e a alta sensibilidade a estímulos como o stress oxidativo, alterações de neurotransmissores, neuroesteróides e receptores correspondentes, torna as crianças um grupo vulnerável à ocorrência destes efeitos secundários. Relativamente ao reposicionamento terapêutico do MTK, este fármaco mostrou um efeito promissor como inibidor da agregação proteica em três modelos experimentais. Ensaios com neurónios isolados também sugerem que o MTK possa desempenhar um papel neuroprotector contra a toxicidade induzida por iões metálicos e agregados proteicos. Além disso, a análise do proteoma sugere que o MTK poderá interferir com proteínas envolvidas na agregação proteica e na clearance de agregados, assim como na estimulação da glicólise e no controlo de resposta ao stress oxidativo. Contudo, foram também identificadas outras proteinas com efeitos opostos, pelo que são necessários ensaios adicionais para explicar o papel do MTK nas doenças neurodegenerativas. Globalmente, este trabalho constitui um contributo inovador para a elucidação dos mecanismos envolvidos nos efeitos neuropsiquiátricos do MTK, e propõe potenciais vias bioquímicas que justificam o reposicionamento terapêutico do MTK em doenças neurodegenerativas.

According to the World Health Organisation, there are approximately 262 million people suffering from asthma in the world. This number is expected to increase since a wide range of environmental risks are associated with asthma development, including tobacco, pollution, and allergens. With no current treatment available, montelukast (MTK) – an antagonist of the cysteinyl leukotrienes receptor 1 – is widely used in the management of symptoms among adults and children. Recently, new molecular targets have been identified and MTK has been proposed for repurposing in other therapeutic applications, with several ongoing clinical trials. The proposed applications include neuroinflammation control, which could be explored in some neurodegenerative disorders, such as Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. However, this drug has been associated with an increasing number of reported neuropsychiatric adverse drug reactions (ADRs), particularly among children, which include symptoms such as agitation, anxiety, depression, sleep disturbance, and suicidal thoughts. Besides, and despite being on the market since 1998, MTK metabolism is still poorly understood and the mechanisms underlying neuropsychiatric ADRs remain unknown. The main goal of this work was to study the in vitro and in vivo MTK metabolism, as well as the metabolic and proteomic pathways affected by the drug, in order to explain its toxicity effects and analyse its potential repurposing applications. An extensive study of MTK metabolism was carried out using in vitro systems, from isolated enzymes and cell fractions to a primary cell model from embryonic chicken brains, and an in vivo model. A group of young healthy mice was treated daily with 1 mg/kg MTK, orally, for one week and selected tissues and fluids were collected for metabolite and protein extraction. Samples were analysed by ultra-high performance liquid chromatography coupled to high-resolution electrospray ionisation mass spectrometry (UHPLC-ESI-HRMS), followed by data analysis and bioinformatics-driven data treatment using software such as XCMS, MetaboAnalyst, and MaxQuant. Metabolism studies allowed the identification of 18 new MTK metabolites: 9 phase I and 9 phase II metabolites. From these, one metabolite elicited special attention due to its potential toxicity: an MTK-glutathione (GSH) conjugate. This metabolite was found in brain tissue and was also formed in vitro both in the presence and the absence of catalysts. The decrease of GSH levels due to MTK conjugation was supported by metabolomics results and could contribute to the dysregulation of neurosignalling pathways. The use of MS-based metabolomics tools to identify the endogenous metabolites whose levels were altered by MTK also showed that MTK is able to dysregulate the hypothalamic pituitary-adrenal axis (HPA) through an increase of corticosterone levels. The hyper-activation of the HPA, coupled to the dysregulation of other neurotransmitters and neurosteroids, and an increased oxidative stress status that were observed could lead to the reported neuropsychiatric ADRs. A proteomics study supported the findings observed in metabolomics; MTK-driven alterations in the levels of proteins involved in other ADRs, such as sleep disorders and stress response, were also identified. Altogether, the results suggest that neuropsychiatric ADRs are most likely to occur primarily in children due to the maturation stage of their brains. The immature brain and the high sensitivity to stimuli at a young age (e.g., oxidative stress, neurotransmitters, neurosteroids, and neurotransmitter receptors) make children a more vulnerable group to these ADRs. Regarding the MTK repurposing applications, MTK shows promising effects as inhibitor of protein aggregation in three in vitro models. Studies using isolated chicken embryo neurons also suggest that MTK could play a protective role against metal ion induced- and protein aggregate-induced toxicity. In addition, proteomics data from mice suggest that MTK is able to interfere with proteins involved in protein aggregation, protein clearance, glycolysis stimulation, and ROS management. However, other proteins with opposed effects were also identified as being up-regulated, whereby additional studies are needed to better understand the role of MTK in neurodegenerative disorders. Overall, this work represents a novel contribution to the elucidation of the mechanisms involved in MTK neuropsychiatric ADRs and to the identification of potential pathways supporting MTK repurposing in neurodegenerative disorders.