Assessing the Role of Nucleocytoplasmic Transport Mechanisms in Machado-Joseph Disease Pathogenesis

Abstract

A doença de Machado-Joseph (DMJ) é uma doença neurodegenerativa caracterizada por uma expansão anormal do número de trinucleótidos CAG no gene ATXN3, traduzindo-se cadeia excessivamente longa de glutaminas na proteína ataxina-3. A formação de agregados nucleares de ataxina-3 em regiões específicas do cérebro é uma característica importante da neuropatologia e progressão desta doença. Os mecanismos celulares de transporte nucleocitoplasmático têm vindo a ganhar atenção na área das doenças neurodegenerativas uma vez que podem explicar a má localização e disfunção de, não apenas proteínas aberrantes associadas a cada doença, mas também de outras macromoléculas que intervêm noutras vias neuronais afetadas. A fim de clarificar o papel das proteínas de transporte nucleocitoplasmáticas na DMJ, um total de 34 proteínas de transporte nucleocitoplasmáticas foram seleccionadas e avaliadas quanto à sua capacidade de modular a agregação de Atxn3 por técnicas de filter trap e análise de fracionamento celular e uma proteína foi selecionada para prosseguir com análises in vitro e in vivo mais detalhadas. A análise de neuropatologia e comportamento num modelo transgênico Q69 de ratinho foi também realizada para avaliar o efeito modulador da proteína de transporte nucleocitoplasmático selecionada. Os nossos resultados demonstraram que o silenciamento da do gene IPO8 (gene que codifica a Importina-8, Imp8) reduz a agregação da Ataxina-3, prevenindo assim a disfunção neuronal e morte celular. O silenciamento do gene Ipo8 in vivo no cerebelo de murganhos transgênicos 69Q levou à melhoria do seu equilíbrio e coordenação motora, apresentando-se como uma estratégia eficiente para retardar a progressão da doença. Adicionalmente, os nossos dados sugerem que a Imp8 pode exercer seu efeito protetor modulando a expressão e atividade de duas outras proteínas, o fator de transcrição p65 da via de sinalização NF-kB (NF-kB/p65) e a Argonauta-2 (Ago2), que também já foram associadas à DMJ. Em conclusão, os nossos dados fornecem evidências de que a Imp8 é uma proteína moduladora da neuropatologia da DMJ, retardando a agregação da ataxina-3 e prevenindo a perda neuronal ao intervir em múltiplas vias neuropatológicas, apresentando-se assim como uma estratégia terapêutica promissora para a doença.

Machado–Joseph disease (MJD) is a neurodegenerative disorder characterized by an abnormal expansion of the number of CAG triplets in the ATXN3 gene, translating into an elongated polyglutamine tract within the ataxin-3 protein. The formation of nuclear ataxin-3 aggregates in neurons of specific brain regions is an important hallmark for disease neuropathology and progression. Accordingly, the nucleocytoplasmic transport mechanisms are gaining increasing attention in the field of the neurodegenerative disorders as they can explain the mislocalization and dysfunction not only of the disease-associated aberrant proteins, but also of other macromolecules intervening in the affected neuronal pathways. In order to understand the role of nucleocytoplasmic transport proteins in MJD, we screened a total of 34 nucleocytoplasmic transport proteins for their capacity to modulate Atxn3 aggregation by filter trap and fractionation analysis and selected an efficient candidate to proceed with further in vitro and in vivo analysis. Neuropathology and behaviour analysis was also performed to evaluate the modulatory effect of the selected nucleocytoplasmic transport protein in the Q69 transgenic MJD mouse model. Our results confirmed that downregulation of Ipo8 (Importin-8 coding gene) reduces Ataxin-3 aggregation, preventing neuronal dysfunction and death. Importantly, in vivo silencing of Ipo8 in the cerebellum of 69Q transgenic mice led to the alleviation of balance and motor coordination impairments, standing as an efficient strategy to delay disease progression. In addition, our data suggest that Importin-8 may exert its protective effect by modulating the expression and activity of two Imp8 described cargos, the Transcription factor 65 of the NF-kB signaling pathway and Argonaute-2, that have also been previously linked with MJD. Overall, our results provide evidence that Imp8 is a modulator of Machado-Joseph neuropathology, and that its silencing delays ataxin-3 aggregation and prevents neuronal loss by intervening in multiple neuropathological pathways, thus, standing as a promising therapeutic strategy for the disease.